5年（2021-2025）高考1年模拟生物真题分类汇编专题09 生物技术与工程（解析版）（黑吉辽蒙专用）

这是一份5年（2021-2025）高考1年模拟生物真题分类汇编专题09 生物技术与工程（解析版）（黑吉辽蒙专用），共37页。试卷主要包含了1×104=1等内容，欢迎下载使用。

考点01发酵工程
1.（2024·黑吉辽）某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病，其筛选流程及抗性检测如图。下列操作正确的是（ ）
A. 在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从感病植株上采集样品
B. 将采集的样品充分消毒后，用蒸馏水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测
C. 将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落
D. 判断内生菌的抗性效果需比较有无接种内生菌的平板上的病原菌菌斑大小
【答案】CD
【解析】
【分析】1、获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。无菌技 术应围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括消毒和灭菌。
2、稀释涂布平板法除可以用于分离微生物外，也常用来 统计样品中活菌的数目。当样品的稀释度足够高时，培养 基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活 菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含 有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数为30〜300 的平板进行计数。
【详解】A、题干信息：某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病，故在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从未感病植株上采集样品，A错误；
B、获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染；将采集的样品充分消毒后，用无菌水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测，B错误；
C、题图可知，样品研磨后进行了稀释涂布，可见将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落，C正确；
D、题图抗性检测可知，判断内生菌的抗性效果需设置对照组和实验组，对照组不接种内生菌得到病原菌菌斑，实验组接种内生菌得到病原菌菌斑，然后比较对照组和实验组的菌斑大小，实验组病原菌菌斑越小表明内生菌抗性效果越好，D正确。
2.（2023·辽宁）细菌气溶胶是由悬浮于大气或附着于颗粒物表面的细菌形成的。利用空气微生物采样器对某市人员密集型公共场所采样并检测细菌气溶胶的浓度（菌落数/m³）。下列叙述错误的是（ ）
A. 采样前需对空气微生物采样器进行无菌处理
B. 细菌气溶胶样品恒温培养时需将平板倒置
C. 同一稀释度下至少对3个平板计数并取平均值
D. 稀释涂布平板法检测的细菌气溶胶浓度比实际值高
【答案】D
【解析】
【分析】稀释涂布平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。
【详解】A、为防止杂菌感染，接种前需要对培养基、培养皿、微生物采样器进行灭菌，对实验操作者的双手进行消毒，A正确；
B、纯化培养时，为防止污染培养基和水分蒸发，培养皿应倒置放在恒温培养箱内培养，B正确；
C、微生物计数时在同一稀释度下，应至少需要对3个菌落数目在30～300的平板进行计数，以确保实验的准确性，C正确；
D、使用稀释涂布平板法对微生物计数，数值往往偏小，原因是两个或多个细胞连在一起时，在平板上只能观察到一个菌落，D错误。
3.（2022·辽宁）为避免航天器在执行载人航天任务时出现微生物污染风险，需要对航天器及洁净的组装车间进行环境微生物检测。下列叙述错误的是（ ）
A. 航天器上存在适应营养物质匮乏等环境的极端微生物
B. 细菌形成菌膜粘附于航天器设备表面产生生物腐蚀
C. 在组装车间地面和设备表面采集环境微生物样品
D. 采用平板划线法等分离培养微生物，观察菌落特征
【答案】D
【解析】
【分析】微生物常见的接种的方法：①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
【详解】A、嗜极微生物适应极端环境的特性使它们有在空间暴露环境或地外星球环境中存活的可能，因此航天器上存在适应营养物质匮乏等环境的极端微生物，A正确；
B、细菌形成菌膜粘附于航天器设备表面产生生物腐蚀，会腐蚀舱内材料以及设备线路、元器件，B正确；
C、对航天器及洁净的组装车间进行环境微生物检测，需要在组装车间地面和设备表面采集环境微生物样品，C正确；
D、航天器及洁净的组装车间环境微生物很少，分离培养微生物，观察菌落特征，不需要采用平板划线法，D错误。
4.（2022·辽宁） β-苯乙醇是赋予白酒特征风味的物质。从某酒厂采集并筛选到一株产β-苯乙醇的酵母菌应用于白酒生产。下列叙述正确的是（ ）
A. 所用培养基及接种工具分别采用湿热灭菌和灼烧灭菌
B. 通过配制培养基、灭菌、分离和培养能获得该酵母菌
C. 还需进行发酵实验检测该酵母菌产β-苯乙醇的能力
D. 该酵母菌的应用有利于白酒新产品的开发
【答案】ACD
【解析】
【分析】选择培养基是根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基，使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选率。
【详解】A、培养基一般选择高压蒸汽灭菌，接种工具一般用灼烧灭菌，A正确；
B、分离纯化酵母菌，操作如下：配制培养基→灭菌→接种→培养→挑选菌落，B错误；
C、为了筛选到目的菌，应该进行发酵实验检测该酵母菌产β-苯乙醇的能力，C正确；
D、筛选到一株产β-苯乙醇的酵母菌可应用于白酒新产品的开发，D正确。
5（2025·黑吉辽蒙）科研人员通过稀释涂布平板法筛选出高耐受且降解金霉素（C22H23ClN2O8）能力强的菌株，旨在解决金霉素过量使用所导致的环境污染问题。下列叙述错误的是（ ）
A．以金霉素为唯一碳源可制备选择培养基
B．逐步提高培养基中金霉素的浓度有助于获得高耐受的菌株
C．配制选择培养基时，需确保pH满足实验要求
D．用接种环将菌液均匀地涂布在培养基表面
【答案】D
【分析】在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
【详解】A、以金霉素为唯一碳源的选择培养基，仅允许能利用金霉素的微生物生长（其他无法利用金霉素的微生物被抑制），符合选择培养基的设计原理，A正确；
B、逐步提高金霉素浓度可模拟环境胁迫，筛选出耐受性更强的菌株（类似“驯化”过程），B正确；
C、培养基的pH需根据目标微生物的生长需求调整（如细菌通常中性偏碱，真菌偏酸性），是配制培养基的基本要求，C正确；
D、稀释涂布平板法需用涂布器将菌液均匀涂布在培养基表面，而接种环用于平板划线法（分离单菌落）。用接种环涂布无法保证菌液均匀，D错误。
6.（2021·辽宁）利用菠萝蜜制作果醋的大致流程为：先在灭菌的果肉匀浆中接种酵母菌，发酵6天后，再接入活化的醋酸杆菌，发酵5天。下列有关叙述错误的是（ ）
A．乙醇既是醋酸发酵的底物，又可以抑制杂菌繁殖
B．酵母菌和醋酸杆菌均以有丝分裂的方式进行增殖
C．酵母菌和醋酸杆菌发酵过程中控制通气的情况不同
D．接入醋酸杆菌后，应适当升高发酵温度
【答案】B
【分析】1、果酒制作的菌种是酵母菌，来源于葡萄皮上野生型酵母菌或者菌种保藏中心，条件是无氧、适宜温度是18～25℃，pH值呈酸性。
2、参与果醋制作的微生物是醋酸菌，其新陈代谢类型是异养需氧型。果醋制作的原理：当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的果糖分解成醋酸。当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。最适温度为30～35℃。
【详解】A、当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸，同时乙醇还可以抑制杂菌繁殖，A正确；
B、酵母菌一般以出芽的方式繁殖，醋酸杆菌以二分裂的方式进行增殖，B错误；
C、酵母菌发酵过程中先通气使其大量繁殖，再密闭发酵产乙醇；醋酸杆菌为好氧菌，需持续通入无菌氧气，C正确；
D、酵母菌适宜温度是18～25℃，醋酸杆菌最适温度为30～35℃，D正确。
考点02 细胞工程和胚胎工程
1.（2024·黑吉辽）从小鼠胚胎中分离获取胚胎成纤维细胞进行贴壁培养，在传代后的不同时间点检测细胞数目，结果如图。下列叙述正确的是（ ）
A. 传代培养时，培养皿需密封防止污染
B. 选取①的细胞进行传代培养比②更合理
C. 直接用离心法收集细胞进行传代培养
D. 细胞增长进入平台期可能与细胞密度过大有关
【答案】B
【解析】
【分析】动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。动物细胞培养需要的条件有：①无菌、无毒的环境；②营养；③温度和pH；④气体环境：95%空气+5%CO2；动物细胞培养技术主要应用在：制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质等。
【详解】A、传代培养时需要营造无菌、无毒以及95%空气+5%CO2的气体环境，而非密封，A错误；
B、选取①的细胞进行传代培养比②更合理，①的细胞核型更为稳定，B正确；
C、对于贴壁生长的细胞进行传代培养时，先需要用胰蛋白酶等处理，使之分散为单个细胞，然后再用离心法收集，C错误；
D、细胞增长进入平台期可能与接触抑制有关，D错误。
2.（2023·辽宁）大量悬浮培养产流感病毒的单克隆细胞，可用于流感疫苗的生产。下列叙述错误的是（ ）
A. 悬浮培养单克隆细胞可有效避免接触抑制
B. 用于培养单克隆细胞的培养基通常需加血清
C. 当病毒达到一定数量时会影响细胞的增殖
D. 培养基pH不会影响单克隆细胞的病毒产量
【答案】D
【解析】
【分析】培养动物细胞使用合成培养基时需要加入血清等一些天然成分，必须保证环境是无菌、无毒的，培养液还需要定期更换。O2是细胞代谢所必需的，CO2主要作用是维持培养液的pH。细胞贴附在培养瓶的瓶壁上称为细胞贴壁，贴壁细胞在生长增殖时会发生接触抑制的现象。
【详解】A、悬浮培养单克隆细胞，可以保证足够的气体交换，通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内，可有效避免接触抑制，A正确；
B、由于细胞的生长是比较复杂的过程，血清中含有一些必须的因子，用于培养单克隆细胞的培养基通常需加血清，B正确；
C、病毒借助于细胞进行繁殖，利用了活细胞的物质、能量、酶等，当病毒达到一定数量时细胞的生命活动受到影响，会影响细胞的增殖，C正确；
D、细胞的正常生命活动需要适宜的pH，培养基pH会影响细胞代谢，进而影响单克隆细胞的病毒产量，D错误。
3.（2022·辽宁）蓝莓细胞富含花青素等多酚类化合物。在蓝莓组织培养过程中，外植体切口处细胞被破坏，多酚类化合物被氧化成褐色醌类化合物，这一过程称为褐变。褐变会引起细胞生长停滞甚至死亡，导致蓝莓组织培养失败。下列叙述错误的是（ ）
A. 花青素通常存在于蓝莓细胞的液泡中
B. 适当增加培养物转移至新鲜培养基的频率以减少褐变
C. 在培养基中添加合适的抗氧化剂以减少褐变
D. 宜选用蓝莓成熟叶片为材料制备外植体
【答案】D
【解析】
【分析】根据题干信息：在蓝莓组织培养过程中，外植体切口处细胞被破坏，多酚类化合物被氧化成褐色醌类化合物，这一过程称为褐变。减少褐变的措施有：减少氧化剂的浓度，如勤换培养基，或添加抗氧化剂。在植物组织培养的过程中，一般选用代谢旺盛、再生能力强的器官或组织为材料制备外植体。
【详解】A、液泡中含有糖类、无机盐、色素和蛋白质等，其中的色素是指水溶性色素，如花青素，A正确；
B、适当增加培养物转移至新鲜培养基的频率可减少代谢积累的氧化剂的浓度，从而减少褐变，B正确；
C、根据题干信息：在蓝莓组织培养过程中，外植体切口处细胞被破坏，多酚类化合物被氧化成褐色醌类化合物，这一过程称为褐变，可知在培养基中添加合适的抗氧化剂以减少褐变，C正确；
D、一般选用代谢旺盛、再生能力强的器官或组织为材料制备外植体，D错误。
4.（2022·辽宁）某抗膜蛋白治疗性抗体药物研发过程中，需要表达N蛋白胞外段，制备相应的单克隆抗体，增加其对N蛋白胞外段特异性结合的能力。
Ⅰ．N蛋白胞外段抗原制备，流程如图1
（1）构建重组慢病毒质粒时，选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因，目的是___________。用脂质体将重组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞，质粒被包在脂质体___________（填“双分子层中”或“两层磷脂分子之间”）。
（2）质粒在包装细胞内组装出由___________组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化N蛋白胞外段。
Ⅱ．N蛋白胞外段单克隆抗体制备，流程如图2
（3）用N蛋白胞外段作为抗原对小鼠进行免疫后，取小鼠脾组织用___________酶处理，制成细胞悬液，置于含有混合气体的___________中培养，离心收集小鼠的B淋巴细胞，与骨髓瘤细胞进行融合。
（4）用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到96孔板，进行___________培养。用___________技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生N蛋白胞外段抗体，又能大量增殖的单克隆杂交瘤细胞株，经体外扩大培养，收集___________，提取单克隆抗体。
（5）利用N蛋白胞外段抗体与药物结合，形成___________，实现特异性治疗。
【答案】（1） ①. 检测目的基因是否成功导入受体细胞 ②. 双分子层中
（2）蛋白质外壳和含N蛋白胞外段基因的核酸
（3） ①. 胰蛋白酶或胶原蛋白 ②. CO2培养箱
（4） ①. 克隆化 ②. 抗原抗体杂交 ③. 细胞培养液
（5）抗体-药物偶联物##ADC
【解析】
【分析】1、单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。
2、两次筛选：①筛选得到杂交瘤细胞（去掉未杂交的细胞以及自身融合的细胞）；②筛选出能够产生特异性抗体的细胞群。
3、杂交瘤细胞的特点：既能大量增殖，又能产生特异性抗体。
【小问1详解】
构建重组慢病毒质粒时，为检测目的基因是否成功导入受体细胞，常选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因。重组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞需要依赖膜融合，故质粒被包在脂质体双分子层中（即磷脂双分子层）。
【小问2详解】
由于目的基因为N蛋白胞外段基因，在包装细胞内组装出由蛋白质外壳和含有N蛋白胞外段基因的核酸组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化N蛋白胞外段。
【小问3详解】
进行动物细胞培养时，需要取小鼠脾组织用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，制成细胞悬液，置于含有95%空气和5%的CO2混合气体的CO2培养箱中培养。
【小问4详解】
用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到96孔板，进行克隆化培养和抗体检测。用抗原抗体杂交技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生N蛋白胞外段抗体，又能大量增殖的单克隆杂交瘤细胞株，经体外扩大培养，收集细胞培养液，提取单克隆抗体。
【小问5详解】
利用N蛋白胞外段抗体与药物结合，形成抗体-药物偶联物ADC，实现特异性治疗。
5．（2025·黑吉辽蒙）利用植物组织培养技术获得红豆杉试管苗，有助于解决紫杉醇药源短缺问题。下列叙述正确的是（ ）
A．细胞分裂素和生长素的比例会影响愈伤组织的形成
B．培养基先分装到锥形瓶，封口后用干热灭菌法灭菌
C．芽原基细胞由于基因选择性表达，不能用作外植体
D．紫杉醇不能通过细胞产物的工厂化生产来获取，植物组织培养优势明显
【答案】A
【分析】植物组织培养技术：1、过程：离体的植物组织，器官或细胞（外植体）→愈伤组织→胚状体→植株（新植体）。2、原理：植物细胞的全能性。3、条件：①细胞离体和适宜的外界条件（如适宜温度、适时的光照、pH和无菌环境等）；②一定的营养（无机、有机成分）和植物激素（生长素和细胞分裂素）。4、植物细胞工程技术的应用：植物繁殖的新途径（包括微型繁殖，作物脱毒、人工种子等）、作物新品种的培育（单倍体育种、突变体的利用）、细胞产物的工厂化生产。
【详解】A、在植物组织培养中，生长素和细胞分裂素的比例直接影响细胞的分化方向。当二者比例适中时，促进愈伤组织的形成；比例过高时促进生根，比例过低时促进生芽，A正确；
B、培养基含大量水分，需用高压蒸汽灭菌法灭菌（121℃，15-30分钟）；干热灭菌法适用于耐高温且干燥的物品（如玻璃器皿），不能用于培养基灭菌，B错误；
C、外植体可以是植物的任何活细胞、组织或器官，只要具有全能性。芽原基细胞是分生组织的一部分，全能性高，可作为外植体。基因选择性表达是细胞分化的基础，不影响其作为外植体的能力，C错误；
D、细胞产物的工厂化生产正是通过植物组织培养技术实现的，如大量培养红豆杉细胞，从培养液中提取紫杉醇。因此，紫杉醇可通过此方法获取，植物组织培养的优势（如快速增殖、大量生产细胞产物）在此体现，D错误。
6．（2025·黑吉辽蒙）研究显示，约70%的小鼠体细胞核移植胚胎未能成功发育至囊胚期，且仅有约2%的胚胎移植到代孕母鼠后可正常发育。下列叙述错误的是（ ）
A．体细胞核进入去核的MⅡ期卵母细胞形成重构胚
B．移植前胚胎发育率低，可能是植入的体细胞核不能完全恢复分化前的功能状态
C．胚胎移植到代孕母鼠后成活率低，可能是早期胚胎未能及时从滋养层内孵化
D．为提高胚胎成活率，可用胚胎细胞核移植代替体细胞核移植
【答案】C
【分析】动物体细胞分化程度高，表现全能性十分困难。因此动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植。胚胎移植是指将通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。其中提供胚胎的个体称为“供体”，接受胚胎的个体叫“受体”。通过任何一项技术（如转基因、核移植和体外受精等）获得的胚胎，都必须移植给受体才能获得后代。
【详解】A、由于M Ⅱ期卵母细胞的细胞更大，便于进行技术操作，细胞质中含有激发细胞核全能性的物质，因此体细胞核移植到去核的MⅡ期卵母细胞形成重构胚，A正确；
B、移植前胚胎发育率低，细胞核来自于已分化的体细胞，全能性容易受到影响，因此可能是植入的体细胞核不能完全恢复分化前的功能状态，B正确；
C、根据题干，早期胚胎大多都不能发育至囊胚期，必然不是孵化的原因，着床在孵化之后发生，孵化是胚胎从透明带中伸展出来（不是滋养层），C错误；
D、胚胎细胞核全能性高于体细胞，因此为提高胚胎成活率，可用胚胎细胞核移植代替体细胞核移植，D正确。
7.（2021·辽宁）下图是利用体细胞核移植技术克隆优质奶牛的简易流程图，有关叙述正确的是（ ）
A．后代丁的遗传性状由甲和丙的遗传物质共同决定
B．过程①需要提供95%空气和5%CO2的混合气体
C．过程②常使用显微操作去核法对受精卵进行处理
D．过程③将激活后的重组细胞培养至原肠胚后移植
【答案】B
【分析】分析图解：图示过程为体细胞克隆过程，取乙牛体细胞，对处于减数第二次分裂中期的卵母细胞去核，然后进行细胞核移植；融合后的细胞激活后培养到早期胚胎，再进行胚胎移植，最终得到克隆牛。
【详解】A、后代丁的细胞核的遗传物质来自甲，细胞质的遗传物质来自于乙牛，则丁的遗传性状由甲和乙的遗传物质共同决定，A错误；
B、动物细胞培养中需要提供95%空气（保证细胞的有氧呼吸）和5%CO2（维持培养液的pH）的混合气体，B正确；
C、过程②常使用显微操作去核法对卵母细胞进行处理，C错误；
D、过程③将激活后的重组细胞培养至囊胚或桑椹胚后移植，D错误。
8.（2025·黑吉辽蒙）下图是制备抗白细胞介素-6（IL-6）单克隆抗体的示意图。下列叙述错误的是（ ）
A．步骤①给小鼠注射IL-6后，应从脾中分离筛选T淋巴细胞
B．步骤②在脾组织中加入胃蛋白酶，制成单细胞悬液
C．步骤③加入灭活病毒或PEG诱导细胞融合，体现了细胞膜的流动性
D．步骤④经过克隆化培养和抗体检测筛选出了杂交瘤细胞
【答案】ABD
【分析】单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。
【详解】A、步骤①给小鼠注射IL-6后，应从小鼠的脾中获取B淋巴细胞，A错误；
B、步骤②需要在组织中加入胰蛋白酶或胶原蛋白酶，使其成为单细胞，进而制成悬液，B错误；
C、步骤③是诱导细胞融合过程，该过程可加入灭活病毒或PEG诱导，细胞融合的过程体现了细胞膜的流动性，C正确；
D、步骤④是在选择培养基上筛选得到的杂交瘤细胞，该过程得到的杂交瘤细胞不一定能产生所需抗体，步骤⑤经过克隆化培养和抗体检测筛选出了分泌所需抗体的杂交瘤细胞，D错误。
考点03 基因工程
1.（2024·黑吉辽）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（ ）
A. 琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B. 凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C. 在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D. 琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
【答案】A
【解析】
【分析】琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的原理主要基于DNA分子在电场作用下的迁移行为以及琼脂糖凝胶的特性。
【详解】A、琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确；
B、 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子， 当溴酚蓝到凝胶2/3处时(可看蓝色条带)，则停止电泳，B错误；
C、在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，C错误；
D、琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，D错误。
2.（2024·黑吉辽）将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒（辅助T-DNA转移）和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。
注：F1-F3，R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。
（1）从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是______。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是______。
（2）本操作中获取目的基因的方法是______和______。
（3）穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是______，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是______。
（4）根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用______基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
（5）为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是______和______。
（6）本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。
A. 通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B. 将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达
C. 将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D. 用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白
【答案】（1） ①. 水解蛋白质，使得DNA与蛋白质分离 ②. 溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA
（2） ①. PCR技术扩增 ②. 人工合成
（3） ①. RNA聚合酶识别并结合的部位 ②. 同时实现两个目的基因的共同表达及调控，从而降低基因工程的成本与复杂性
（4）HygBR （5） ① F3 ②. R2 （6）CD
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
【小问1详解】
从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是水解蛋白质，使得DNA与蛋白质分离。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA。
【小问2详解】
本操作中获取目的基因的方法是人工合成和PCR技术扩增。
【小问3详解】
穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是RNA聚合酶识别并结合的部位，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是同时实现两个目的基因的共同表达及调控，从而降低基因工程的成本与复杂性。
【小问4详解】
结合基因表达载体的示意图，根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用HygBR基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
【小问5详解】
为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是F3和R2。
【小问6详解】
蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求，本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列、用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白，AB不符合题意，CD符合题意。
故选CD。
3.（2023·辽宁）CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（ ）
A. CD163基因中编码起始密码子的序列
B. CD163基因中编码终止密码子的序列
C. RFP基因中编码起始密码子的序列
D. RFP基因中编码终止密码子的序列
【答案】B
【解析】
【分析】基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因启动子终止子和标记基因等。
【详解】为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，则拼接在一起的红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因都得转录和翻译，使其表达成一条多肽，因此拼接在一起的CD163基因转录形成的mRNA中不能出现终止密码子，否则红色荧光蛋白RFP基因转录形成的mRNA不能进行翻译，无法合成红色荧光蛋白，因此该拼接过程的关键步骤是除去CD163基因中编码终止密码子的序列，B符合题意，ACD不符合题意。
4.（2023·辽宁）天然β淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR改造β-淀粉酶基因，并将改造的基因与pLN23质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下列问题：
（1）上述过程属于_____工程。
（2）PCR中使用的聚合酶属于_____（填写编号）。
①以DNA为模板的RNA聚合酶 ②以RNA为模板的RNA聚合酶
③以DNA为模板的DNA聚合酶 ④以RNA为模板的DNA聚合酶
（3）某天然β-淀粉酶由484个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明显提升。在图1所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是_____（填写编号）。
（4）为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2所示的pLN23质粒构建得到基因表达载体。除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和_____。
（5）目的基因（不含EcRI酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I位点。用EcR I酶切来自于不同大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度，这一操作的目的是_____。正确连接的基因表达载体被EcR Ⅰ酶切后长度为_____kb。
（6）采用PCR还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过_____反应获得PCR的模板。
【答案】（1）蛋白质 （2）③ （3）②
（4）标记基因 （5） ①. 筛选导入目的基因的大肠杆菌 ②. 5.7
（6）逆转录
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【小问1详解】
根据蛋白质的功能改变基因的结构，最终获得耐高温的β-淀粉酶，这属于蛋白质工程。
【小问2详解】
PCR的原理是DNA双链复制，利用的酶是耐热的DNA聚合酶，合成子链时是以DNA为模板。
【小问3详解】
根据β-淀粉酶的编码序列，替换的碱基在编码序列中，则利用的引物应该把编码序列全部扩增在内，则所用的引物是②③。含已替换碱基的引物是②。
【小问4详解】
作为基因工程载体的质粒应该包含：复制原点、限制酶的切割位点、标记基因、启动子和终止子，根据图示的表达载体可知应还要包括目的基因和标记基因。
【小问5详解】
目的基因通过表达载体导入大肠杆菌中，大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度，这一操作的目的是筛选出导入目的基因的大肠杆菌。正确连接的基因表达载体只有一个EcR Ⅰ酶切位点，则切割后的长度为4.2+1.5=5.7kb。
【小问6详解】
转录是以DNA为模板合成RNA的过程，通过PCR在分子水平上确定目的基因是否转录，则需要以RNA为模板逆转录出DNA作为PCR反应的模板。
5.（2022·辽宁）抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据，采用PCR方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A. 预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B. 后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C. 延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D. 转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
【答案】B
【解析】
【分析】PCR过程为：①变性，当温度上升到90℃以上时，氢键断裂，双链DNA解旋为单链；②复性，当温度降低到50℃左右是，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；③延伸，温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸，在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
【详解】A、预变性是使模板DNA充分变性，A错误；
B、后延伸过程后延伸是为了让引物延伸完全并让单链产物完全退火形成双链结构，可使目的基因的扩增更加充分，B正确；
C、延伸过程需引物参与，C错误；
D、转基因品种不只需要检测是否含有目的基因，还要检测是否表达，还有安全性问题，D错误；
6.（2025·黑吉辽蒙）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。
(1)可从 中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入 和 限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用 连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。
(2)进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有 的污染。初步判断实验组 （从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是 。
(3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有 。
a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3'
b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3'
c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3'
d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3'
(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。
【答案】(1) 基因数据库/序列数据库 Xh Ⅰ Xba Ⅰ DNA 连接酶
(2) 试剂 1 目的基因N大小为2.3kb
(3)GCC
(4)香树脂醇
【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。
【详解】（1）GenBank是目前国际上广泛使用 的序列数据库之一，它的数据主要是各国的 实验室、测序机构等发布的序列信息。利用这个数据库，我们可以便捷地检索到基因和蛋白质的序列信息；故可从序列数据库或基因数据库中查询基因N的编码序列，设计特定引物。保证基因N与质粒pYL正确连接，需要使用双酶切法，为了目的基因能正确表达，目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间，且质粒和目的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏性末端的酶；分析图1可知，质粒pYL应该选用Spe Ⅰ和Xh Ⅰ酶切，由于目的基因N含有Spe Ⅰ识别序列，故N基因不能使用Spe Ⅰ酶切，但Xba Ⅰ与其具有相同的黏性末端，基因N酶切时可以用Xba Ⅰ替换Spe Ⅰ，即N基因两端应该含有Xba Ⅰ和Xh Ⅰ识别序列；题干信息：N基因a链为转录模板链，才有引物1和引物2扩增N基因，则扩增后模板链的5'端含有引物1序列，而编码链的5'端含有引物2序列，结合质粒pYL上的启动子和终止子方向，可知应该在引物2需要5'端添加Xba Ⅰ、引物1 5'端添加Xh Ⅰ识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用DNA连接酶连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。
（2）构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变，而质粒pYL本身7.2kb，可知目的基因N大小为2.3kb；分析电泳图可知，初步判断实验组1的质粒中成功插入了基因N。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应体系是否存在污染，即检验PCR反应中是否有试剂污染。
（3）编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA；密码子位于mRNA上，mRNA上的序列与编码链序列相似，而a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），可知a引物延申后的序列为编码链；b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同，分析题图bcd序列可知c是诱变第243位苯丙氨酸的引物，且c引物延申后的序列为编码链，根据a引物5'-端首位GCA为240位，则c引物5'-端GCC为243位，故据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有GCC。
（4）题干研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇；由此可知，进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。
7．（2021·辽宁）PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0．9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
(1)为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经 过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
(2)图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入 和 两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用 （填“E．cliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）。
相关限制酶的识别序列及切割位点
注：箭头表示切割位点
(3)转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于 的生理状态，以提高转化效率。
(4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2， 号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0．2kb的DNA分子条带未出现在图中
(5)将纯化得到的PHB2蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24小时后，检测处于细胞周期（示意图见图3）不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是将细胞阻滞在细胞周期的 （填“G1”或“S”或“G2/M”）期。
【答案】(1)逆转录
(2) EcRI PvitⅡ T4DNA连接酶
(3)感受态
(4)3
(5)G2/M
【分析】分析图中质粒含有多个限制酶切位点，在启动子和终止子之间有三个酶切位点，KpnI在质粒上有两个酶切位点，PvitⅡ酶切后获得平末端。
图4中G1期和S期细胞减少，而G2期细胞数目明显增多。
将目的基因导入微生物细胞：Ca2+处理法。
【详解】（1）利用RNA获得cDNA的过程称为逆转录。
（2）根据启动子和终止子的生理作用可知，目的基因应导入启动子和终止子之间．图中看出，两者之间存在于三种限制酶切点，但是由于KpnI在质粒上不止一个酶切位点，所以应该选择EcRI和PvitⅡ两种不同限制酶的识别序列；根据PvitⅡ的酶切序列，切出了平末端，所以构建基因表达载体时，应该用T4DNA连接酶连接质粒和目的基因。
（3）转化时用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于感受态的生理状态，以提高转化效率。
（4）由于这些菌落都可以生长在含有氨苄青霉素的培养基中，因此都含有质粒，重组质粒包含了目的基因和质粒，如果用EcRI和PvitⅡ两种酶切割重组质粒电泳后将获得含有质粒和目的基因两条条带，由于phb2基因大小为0．9kb，所以对应电泳图是菌落3。
（5）比较图4中G1期和S期细胞减少，而G2期细胞数目明显增多，说明了G1期和S期细胞可以进入G2期，而G2期的细胞没有能够完成分裂进入G1期，因此PHB2蛋白应该作用于G2/M期。
一、单选题
1．（2025·辽宁·模拟预测）防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物是研究和应用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础。下列相关说法正确的是（ ）
A．只有在固体培养基表面才能生长出微生物菌落
B．固体培养基在高压蒸汽灭菌后应迅速倒平板，以防止凝固
C．为了涂布均匀，涂布时可转动培养皿，涂布后立刻将培养皿倒置，放入培养箱中培养
D．耐高温和需要保持干燥的物品，可以采用干热灭菌法，如玻璃器皿
【答案】D
【分析】实验室常用的灭菌方法：
1.灼烧灭菌：将微生物的接种工具，如接种环、接种针或其他金属工具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌，此外，在接种过程中，试管口或瓶口等容易被污染的部位，也可以通过火焰燃烧来灭菌；
2.干热灭菌：能耐高温的，需要保持干燥的物品，如玻璃器皿（吸管、培养皿）和金属用具等，可以采用这种方法灭菌；
3.高压蒸汽灭菌：将灭菌物品放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内，为达到良好的灭菌效果，一般在压力为100kPa，温度为121℃的条件下，维持15～30min。
【详解】A、微生物在固体培养基表面或内部生长，可以形成肉眼可见的菌落，A错误；
B、灭菌后，待培养基冷却至50℃左右时再倒平板，B错误；
C、应待涂布的菌液被培养基吸收后，再将平板倒置，C错误；
D、耐高温和需要保持干燥的物品，如玻璃器皿、金属用具等，可以采用干热灭菌法，D正确。
2．（2025·辽宁沈阳·三模）现代生物技术流程中，“筛选”至关重要。下列叙述正确的是（ ）
A．以尿素为唯一碳源的培养基可用于筛选土壤中的尿素分解菌
B．利用选择培养基可以筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
C．筛选透明带厚的原肠胚进行移植有利于胚胎的保护和孵化
D．利用滋养层细胞进行性别筛选有助于构建乳腺生物反应器
【答案】D
【分析】微生物筛选的关键是选择培养基的使用，通过选择培养混合的微生物，仅得到或筛选出所需要的微生物，其他微生物在选择培养基上是不能生存或生存受到抑制。
【详解】A、以尿素为唯一氮源的培养基上，其他微生物因为缺少氮源而不能生存，故可以筛选出尿素分解菌，A错误；
B、通过特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞后，还需进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交 瘤细胞，B错误；
C、在胚胎移植过程中，通常选择发育良好、形态正常的桑葚胚或囊胚进行移植，而不是原肠胚，C错误；
D、乳腺生物反应器是利用基因工程技术将外源基因导入动物受精卵或早期胚胎中，使其整合到宿主基因组上并稳定遗传给后代，通过分泌的乳汁来生产人类所需要的药品或生物制品。在构建乳腺生物反应器的过程中，通常是通过性别鉴定来选择雌性动物进行移植，因为雌性动物才能分泌乳汁，故取滋养层细胞做DNA分析来进行性别鉴定，D正确。
3．（2025·辽宁·三模）为提高作物产量，种植业往往使用大量的氮肥，既增加了生产成本，又易造成环境污染。固氮菌能固定氮气，为植物生长提供充足的氮元素，常见的固氮菌有根瘤菌和圆褐固氮菌等。科研人员进行了土壤中自生固氮菌的分离和固氮能力测定的研究，部分实验流程如下图。以下叙述正确的是（ ）
A．根瘤菌与豆科植物共生后才能固氮，其合成固氮酶所需的核糖体和氨基酸均来源于植物细胞
B．圆褐固氮菌能在不加氮源的培养基中生长，说明圆褐固氮菌为自养型生物
C．将土壤悬液用无菌水梯度稀释后涂布到含青霉素的选择培养基上，以抑制其他微生物的生长
D．若④统计的菌落数分别是132、136、128，则每克土壤中含有的固氮菌为1.32×107个
【答案】D
【分析】用稀释涂布平板法测定菌落数时，在每一个梯度浓度内，至少要涂布3个平板，选择菌落数在30～300的进行记数，求平均值，再通过计算得出总数。
【详解】A、固氮酶是根瘤菌自身合成的，植物为根瘤菌提供有机物和能量，其合成所需的核糖体和氨基酸来源于根瘤菌自身，A错误；
B、圆褐固氮菌是自生固氮菌，可以在无氮培养基中生长，因为它能固定空气中的氮气，自养型生物是指能利用无机碳源（如CO2）合成有机物的生物，而异养型生物需要现成的有机物，圆褐固氮菌的碳源是现成的有机物（如葡萄糖），说明圆褐固氮菌为异养型生物，B错误；
C、青霉素是一种抗生素，可以抑制大多数细菌（尤其是革兰氏阳性菌）的生长，圆褐固氮菌属于革兰氏阴性菌，对青霉素不敏感，将土壤悬液用无菌水梯度稀释后涂布到含青霉素的选择培养基上，可以抑制部分微生物的生长，但是不能抑制所有微生物的生长，C错误；
D、若④统计的菌落数分别是132、136、128，根据计算公式（C÷V×M），④的稀释倍数为104，则每克土壤中含氮菌约为（132+136+128）÷3÷0.1×104=1.32×107个，D正确。
4．（2025·辽宁·模拟预测）下列关于微生物的选择培养和计数方法的叙述，正确的是（ ）
A．用营养齐全的培养基在80℃下培养栖热菌不属于选择培养
B．不含氮源或碳源的培养基不能用于微生物的培养
C．从加入抗生素、无氧环境下的培养基中筛选出的不一定是厌氧真菌
D．含菌溶液的稀释倍数并不会影响活菌计数法计数结果的准确度
【答案】C
【分析】1、培养基除了含有水、碳源、氮源和无机盐等营养物质外，还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。
2、由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
【详解】A、用营养齐全的培养基在80℃下培养栖热菌属于选择培养，因为只有耐热的细菌才能在80℃下存活，A错误；
B、不含氮源的培养基可用于固氮微生物的培养，不含碳源的培养基可以用于自养型微生物的培养，B错误；
C、加入抗生素、无氧环境下的培养基筛选出的也可能是酵母菌，酵母菌属于兼性厌氧真菌，C正确；
D、含菌溶液的稀释倍数如果太低，多个菌落重叠，会导致无法计数，稀释倍数如果太高，则可能无法得到菌落，D错误。
5．（2025·辽宁·模拟预测）浆水是某省非常独特的发酵食品，明代医学家李时珍在其《本草纲目》中也有专门记述，“浆水能调中益气，宣和强力，止咳消食，利小便”。科研 工作者从浆水中分离得到了厌氧益生菌发酵黏液乳杆菌GR-3，并有望将其用于疾病治疗。下列关于利用发酵工程生产发酵黏液乳杆菌GR-3的叙述，正确的是（ ）
A．优良的发酵黏液乳杆菌GR-3可从自然界筛选，也可通过基因工程育种改良性状
B．发酵工程中，可先通气再进行密闭，以提高发酵黏液乳杆菌GR-3的菌体数量
C．若要获得发酵黏液乳杆菌GR-3的单细胞蛋白，需将细胞进行去壁、破碎等操作
D．发酵罐内的发酵是发酵工程的中心环节，培养基的配方不会影响发酵产物的产量
【答案】A
【分析】发酵罐内的发酵是发酵工程的中心环节。微生物培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。对异养微生物来说，含C、N的化合物既是碳源，也是氮源，即有些化合物作为营养要素成分时并不是起单一方面的作用。
【详解】A、优良的发酵黏液乳杆菌GR-3可从自然界筛选，也可通过诱变育种或基因工程育种获得，A正确；
B、发酵黏液乳杆菌GR-3为厌氧菌，有氧气存在会抑制发酵过程的进行，降低菌体的数量，B错误；
C、单细胞蛋白为微生物菌体，无需进行去壁、破碎等操作，C错误；
D、发酵罐内的发酵是发酵工程的中心环节，培养基的配方会影响发酵产物的产量，D错误。
6．（2025·辽宁·模拟预测）酸笋是竹笋通过微生物发酵工艺制作而成的传统食品，具有独特的酸味和香气。下图为利用乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等微生物发酵制作酸笋的工艺流程图，有关叙述合理的是（ ）
A．杀青、漂烫步骤是通过高温灭菌避免杂菌污染
B．酸笋的酸味以乳酸菌产生乳酸为主，接种菌种后需立即通入氧气
C．醋酸菌能将酵母菌产生的乙醇氧化为醋酸，进一步丰富酸笋的酸味层次
D．发酵过程中要随时检测培养液中微生物数量，可以采用平板划线法和稀释涂布平板法
【答案】C
【分析】微生物接种常用的两种方法：①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过足够稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后，可形成单菌落。
【详解】A、在选材、清洗、切割后进行杀青、漂烫，目的是给材料消毒，而不是灭菌，A错误；
B、酸笋中的细菌微生物以乳酸菌为主，乳酸菌的代谢类型为异养厌氧型，因此接种菌种后立即通入氧气会抑制乳酸菌的发酵，影响发酵效果，B错误；
C、参与酸笋发酵的微生物还有酵母菌和醋酸菌，酵母菌将糖类分解产生酒精（乙醇）和二氧化碳，醋酸菌将乙醇氧化为醋酸，进一步丰富酸笋的酸味层次，C正确；
D、发酵过程中要随时检测培养液中微生物的数量、产物的浓度等，以了解发酵的进程，平板划线法和稀释涂布平板法可以接种并分离微生物，但平板划线法不可以用来计数，D错误。
7．（2025高三下·黑龙江模拟）配制伊红-亚甲蓝琼脂培养基可用于鉴定大肠杆菌，生长在此培养基上的大肠杆菌菌落呈深紫色，并有金属光泽。下图为检测大肠杆菌对某种抗生素的敏感性进行的实验，图示培养两天后所见结果(①②③为加有不同浓度抗生素的圆纸片)。下列相关叙述正确的是
A．接种用的方法是平板划线法
B．实验表明不同种的大肠杆菌对同一种抗生素敏感性不同
C．①②③周围透明圈的大小差异可能与培养基的氮源不同有关
D．浸有无菌水的圆纸片在本实验中作为空白对照
【答案】D
【分析】抑菌圈的大小可以表示大肠杆菌对抗生素的敏感性的大小，抑菌圈越大说明大肠杆菌对该种抗生素越敏感，否则越不敏感。图中②的抑菌圈最大，大肠杆菌对该种抗生素最敏感。
【详解】A、该实验的接种方式是稀释涂布平板法，A错误；
B、从图中看出，接种不同浓度抗生素的圆纸片周围的抑菌圈大小不同，说明同一种大肠杆菌对不同浓度抗生素的敏感度不同，B错误；
C、本培养基的氮源是相同的，C错误；
D、浸有无菌水的圆纸片在本实验中作为空白对照，D正确。
8．（2025·辽宁·二模）玉米赤霉烯酮（ZEN）是一种由镰刀菌属真菌产生的真菌毒素，研究人员从连作玉米田的土壤样品中分离出了可高效降解ZEN的细菌菌株，实验流程如图。下列叙述错误的是（ ）
A．步骤②③④中所用的培养基均为以ZEN为唯一碳源的选择培养基
B．实验过程中，需要将培养皿、培养瓶和培养基进行干热灭菌
C．步骤③中培养基上长出的菌落数量可能约等于涂布到平板上的活菌数量
D．可衡量b瓶中菌株的ZEN降解能力
【答案】B
【分析】1、培养基一般使用高压蒸汽灭菌法灭菌，培养皿使用干热灭菌法灭菌，接种环、涂布器使用灼烧灭菌法灭菌。
2、在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。虽然各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源（提供碳元素的物质）、氮源（提供氮元素的物质）和无机盐。
【详解】A、为分离出可高效降解ZEN的细菌菌株，因此培养基中应以ZEN为唯一碳源，A正确；
B、培养基通常采用的是高压蒸汽灭菌，涂布器一般使用灼烧灭菌，B错误；
C、理论上，当接种的菌液稀释度足够高时，一个活菌会形成一个菌落。 所以步骤③中培养基上长出的菌落数量理论上可能等于涂布到平板上的活菌数量，C正确；
D、a瓶ZEN浓度代表初始ZEN浓度，“a瓶ZEN浓度-b瓶ZEN浓度”代表菌株降解的ZEN浓度，因此“（a瓶ZEN浓度-b瓶ZEN浓度）/a瓶ZEN浓度”代表菌株的ZEN降解率，可衡量b瓶中菌株的ZEN降解能力，D正确。
9．（2025·辽宁鞍山·三模）紫花苜蓿是一种豆科牧草，富含植物蛋白，家畜采食后会鼓胀；百脉根富含单宁，单宁可与植物蛋白结合，不引起家畜采食后鼓胀。科研人员利用野生型清水紫花苜蓿和里奥百脉根为材料，培育出抗肥胖鼓胀病的苜蓿新品种，研究主要流程如图（注：IOA可抑制植物细胞呼吸第一阶段，R—6G可阻止线粒体的呼吸作用，二者有效抑制不同植物细胞正常代谢的临界浓度不同）。下列叙述错误的是（ ）
A．过程③表示再分化过程，诱导出芽和诱导生根不需要更换培养基
B．①过程实现了原生质体融合，其中只有异源融合体才能存活和具有再生能力
C．图中植物体细胞杂交技术实现了远缘杂交育种
D．图中再生植株培育的生物学原理主要是细胞膜的流动性及植物细胞的全能性
【答案】A
【分析】植物组织培养是指利用特定的培养将离体的植物细胞、组织或器官培养成完整植株的过程，所以花药的离体培养、基因工程中的受体细胞的培养、植物体细胞杂交后杂种细胞的培养以及植物的大量快速繁殖都要用到植物组织培养技术。植物组织培养的过程是外植体→脱分化→愈伤组织→再分化→根、芽→试管苗。植物体细胞杂交是指将植物不同种的原生质体通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术。
【详解】A、过程③表示再分化过程，在植物组织培养中，诱导出芽和诱导生根所需的生长素和细胞分裂素的比例不同，通常需要更换培养基，A错误；
B、①过程是原生质体融合过程，由于用R-6G处理清水紫花苜蓿原生质体及同源融合体不能再生愈伤组织，用IOA处理里奥百脉根原生质体及同源融合体不能再生愈伤组织，而异源融合体可以避开这两种抑制，所以只有异源融合体才能存活和具有再生能力，B正确；
C、植物体细胞杂交技术可以克服远缘杂交不亲和的障碍，实现远缘杂交育种，图中就是利用该技术培育新品种，C正确；
D、图中首先通过原生质体融合，利用了细胞膜的流动性，然后将杂种细胞培育成再生植株，利用了植物细胞的全能性，D正确。
10．（2025·辽宁·三模）甲植物细胞的核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞的质基因具有高产效应。某研究小组用甲、乙两种植物（均为二倍体）进行体细胞杂交相关研究，最终获得了高产、耐盐碱的杂种植株丙，其基本操作流程如图。为获得目的植株，下列相关操作正确的是（ ）
A．对外植体消毒时，使用体积分数为95%的酒精比70%的酒精消毒效果更好
B．过程A可用纤维素酶和果胶酶处理，需在低渗溶液中进行，以防止过度失水而死亡
C．过程C中需用PEG来诱导原生质体再生出新的细胞壁
D．杂种细胞经植物组织培养形成可育二倍体，还需在个体水平做鉴定才能筛选出高产、耐盐碱的杂种植株丙
【答案】D
【分析】原生质体是去除细胞壁后各种结构的总称，包括细胞膜、细胞质、细胞核和细胞器等。在植物体细胞杂交过程中常采用人工诱导的方法促进原生质体的融合，诱导方法包括两大类：物理法和化学法。化学法一般常用聚乙二醇作为诱导剂。
【详解】A、对外植体消毒，使用70%的酒精效果更好，A错误；
B、植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，用纤维素酶和果胶酶处理可去除细胞壁，获得原生质体，不能在低渗溶液中进行，否则原生质体会吸水涨破，B错误；
C、PEG诱导原生质体融合，而不是诱导原生质体再生出细胞壁，C错误；
D、图中用紫外线照射使乙原生质体的细胞核失去活动，所以融合形成杂种细胞经植物组织培养形成可育二倍体，同时还需在个体水平做鉴定才能筛选出高产、耐盐碱的杂种植株丙，D正确。
11．（2025·辽宁·二模）抗原表位指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，是抗原与T细胞或B细胞表面的抗原识别受体及抗体特异性结合的最小结构单位。下图为单克隆抗体的制备过程，下列叙述错误的是（ ）
A．可用PEG或灭活的病毒诱导骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合
B．经选择培养基筛选所得的杂交瘤细胞能够产生的抗体共3种
C．克隆化培养和抗体检测后的每个杂交瘤细胞只能产生1种抗体
D．由图可知，利用一种抗原经杂交瘤技术可以获得多种单克隆抗体
【答案】B
【分析】单克隆抗体的制备:（1）制备产生特异性抗体的B淋巴细胞：向免疫小鼠体内注射特定的抗原，然后从小鼠脾内获得相应的B淋巴细胞。（2）获得杂交瘤细胞①将鼠的骨髓瘤细胞与脾细胞中形成的B淋巴细胞融合；②用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞，该杂种细胞既能够增殖又能产生抗体。（3）克隆化培养和抗体检测。（4）将杂交瘤细胞在体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖。（5）提取单克隆抗体：从细胞培养液或小鼠的腹水中提取。
【详解】A、在单克隆抗体制备过程中，灭活的病毒（如仙台病毒）是常用的细胞融合诱导剂，用于促进骨髓瘤细胞与B淋巴细胞的融合，A正确；
B、经选择培养基筛选后，由于B细胞有多种，杂交瘤细胞能够产生的抗体有多种，B错误；
C、克隆化培养和抗体检测的目的是筛选出单一克隆的杂交瘤细胞，每个克隆只能产生一种特异性抗体，C正确；
D、利用一种抗原，可以通过杂交瘤技术获得针对该抗原不同表位的多种单克隆抗体，D正确。
12．（2025·辽宁·二模）与常规栽培技术相比，利用植物细胞培养进行药用次生代谢产物的生产具有显著的优越性，根据不同的需求可以采用不同的技术流程（如下图）。下列相关叙述错误的是（ ）
A．培养体系1、2、3中的细胞基因型不完全相同
B．上图的过程与植物组织培养都需要更换培养基
C．将目标产物合成途径中的关键酶基因导入悬浮细胞，可用花粉管通道法
D．愈伤组织没有叶绿体，是异养型细胞，因此需在培养基中加入有机碳源
【答案】C
【分析】植物组织培养就是在无菌和人工控制的条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。
【详解】A、由图可知，体系1经转基因细胞系筛选培养获得，故其基因型与体系2和体现3不同，A正确；
B、植物激素的浓度和比例等都会影响植物细胞的发育方向。结合图示，培养体系3先需要利用外植体诱导培养产生愈伤组织，再转移到诱导生根的培养基上产生毛状根，即上图过程中需要更换培养基，B正确；
C、花粉管通道法是指在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。故将目标产物合成途径中的关键酶基因导入悬浮细胞，不可用花粉管通道法，C错误；
D、在具有叶片分化之前植物细胞不能进行光合作用，所以植物组织培养的培养基中需要加入有机营养物质，D正确。
13．（2025·辽宁·模拟预测）聚合酶链式反应（PCR）是一种用于扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。以下图DNA为模板，扩增n次后（n≥1），与已知序列两条链等长的子代DNA分子数为（ ）
A．2n+1－n－2B．2n－2n
C．2n－2D．2n－n－1
【答案】D
【分析】PCR技术利用DNA双链复制的原理，在体外快速复制DNA，使DNA呈指数式增长，条件需要模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。
【详解】PCR技术以DNA双链为模板进行半保留复制，每次扩增后，DNA分子数量呈指数增长，扩增n次后，DNA分子总数为2n个，原始的这一个DNA分子，两条链（A链和B链）中只有已知序列部分是我们关注的用于与子代对比的部分，在PCR扩增过程中，最初的模板DNA的两条链会一直存在于子代DNA中，设与已知序列两条链等长的子代DNA分子数为x，已知扩增n次后DNA分子总数为2n，那么不符合要求的数量为n+1（其中1是原始模板DNA，n是在扩增过程中产生的长度不符合要求的新合成DNA，因为每次扩增都会产生一些长度不符合的DNA，总共扩增n次 ），根据DNA分子总数与不符合要求的数量关系，可列出等式x+n+1=2n，通过移项可得x=2n-n-1，ABC错误，D正确。
二、多选题
14．（2025·辽宁营口·三模）发根农杆菌内含有Ri质粒，经过转化可以使植物产生大量毛状根，由毛状根再生的植株往往表现出叶皱、节间短、顶端优势弱等特征。下列是利用发根农杆菌转化青蒿外植体的基本流程。下列相关说法正确的是（ ）
A．Ri质粒上可能存在使植物生成毛状根的基因
B．步骤③加入抗生素的目的是杀死发根农杆菌
C．青蒿组织培养的脱分化和再分化过程中不需要光照处理
D．步骤④加入的生长素和细胞分裂素用量的比值应该小于1
【答案】AB
【分析】植物组织培养的原理是植物细胞具有全能性，其过程为：离体的植物组织，器官或细胞经过脱分化过程形成愈伤组织(高度液泡化，无定形状态薄壁细胞组成的排列疏松、无规则的组织)，愈伤组织经过再分化过程形成胚状体，进一步发育成为植株。
【详解】A、发根农杆菌内含有Ri质粒，经过转化可以使植物产生大量毛状根，推测发根农杆菌的Ri质粒上可能存在使植物生成毛状根的基因并在转化后得以表达，A正确；
B、步骤③发根农杆菌已经转化完毕，可以用抗生素杀死，也可以防止其它杂菌的污染，影响培养效果，B正确；
C、植物组织培养包括脱分化和再分化两个过程，其中脱分化过程不需要光照，而再分化过程需要光照，C错误；
D、步骤④的培养基诱导生根，加入的生长素和细胞分裂素用量的比值应该大于1，D错误。
15．（2025·辽宁·三模）2018年《细胞》期刊报道，中国科学家率先成功应用体细胞对非人灵长类动物进行克隆，成功培育了体细胞克隆猴——“中中”和“华华”，流程如下，下列叙述错误的是（ ）
A．体外培养猴甲的体细胞时，需提供5%CO2的主要目的是促进细胞进行呼吸作用
B．采集到的卵母细胞培养到MⅡ期再通过显微操作去除其核膜包被的细胞核
C．表达的Kdm4d使重构胚中染色质组蛋白的甲基化程度降低以促进相关基因的表达，同时还常用乙醇、Ca2+载体等方法激活重构胚，使其完成分裂和发育的进程
D．在胚胎移植后，还需对代孕母猴注射免疫抑制剂，防止免疫排斥的发生
【答案】ABD
【分析】细胞核移植概念：将动物的一个细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。
【详解】A、体外培养猴甲的体细胞时，需提供5%CO2的主要目的是维持培养液的pH，A错误；
B、将卵母细胞培养到MII期后进行去核操作，此时没有细胞核，出现的是纺锤体-染色体复合物，故去核的实质是去除卵母细胞中的纺锤体-染色体复合物，B错误；
C、结合题意和图示操作可知，表达的去甲基化酶Kdm4d使重构胚中染色质组蛋白的甲基化程度降低，以促进相关基因的表达，同时还常用乙醇、Ca2+载体等方法激活重构胚，使其完成分裂和发育的进程，C正确；
D、代孕母猴在胚胎移植前应进行同期发情处理以使其与供体处于相同的生理状态，但由于受体对外来胚胎几乎不发生免疫排斥，因此不需要对代孕母猴注射免疫抑制剂，D错误。
16．（2025高三下·黑龙江）下图表示抗人体胃癌的单克隆抗体的制备过程，有关叙述正确的是（ ）
A．图中实验小鼠注射的甲是能与抗人体胃癌抗体特异性结合的抗原
B．利用聚乙二醇、灭活的病毒和电融合等方法均可诱导细胞融合获得乙
C．用特定的选择培养基对乙筛选，融合细胞均能生长，未融合细胞均不能生长
D．丙需要进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选后可获得大量能分泌所需抗体的丁
【答案】ABD
【分析】单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养或注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。
【详解】A、图中实验小鼠注射的甲是能与抗人体胃癌抗体特异性结合的抗原，以刺激机体产生相应的B细胞，A正确；
B、诱导动物细胞融合的方法有物理方法、化学方法等，利用聚乙二醇、灭活的病毒和电融合法等方法均可诱导动物细胞融合获得乙，B正确；
C、用特定的选择培养基对乙筛选，只有杂种融合细胞能生长，未融合细胞和同种细胞的融合体不能生长，C错误；
D、对筛选出的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，多次筛选后可获得既能无限增殖又能产生单一抗体的杂交瘤细胞丁，D正确。
三、实验题
17．（2025·辽宁沈阳·三模）大豆脂肪氧化酶（LOX）在食品加工等方面有重要作用。下图表示建立LOX基因原核表达体系生产LOX的过程。其中Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，T7启动子可被IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）激活。回答下列问题。
(1)①RT-PCR（逆转录PCR）获得LOX基因（cDNA）的过程需要 的催化。为了便于基因表达载体的构建，引物F1和R1分别为 。
A．5′-GGTACCGTAGTGTTGGTGGGTTGG-3′
B．5′-CTCGAGAAAGCCAAACATGAAAGC-3′
C．5′-GGTACCAAAGCCAAACATGAAAGC-3′
D．5′-CTCGAGGTAGTGTTGGTGGGTTGG-3′
(2)图中代表基因工程核心步骤的是 （填序号）。③过程需用 处理大肠杆菌，以利于重组质粒的转化。仅利用含氨苄青霉素的培养基无法区分含有 的大肠杆菌，因此还需利用PCR等技术在 水平上对大肠杆菌进行检测与筛选。筛选后的大肠杆菌用于生产时，除营养物质外，培养基中还需添加 。
(3)已知天然的LOX具有使β-胡萝卜素漂白褪色的特性。简要叙述利用以上过程生产的LOX进行活性鉴定的实验设计思路： 。
【答案】(1)逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶 AB
(2)② Ca2+ 重组质粒和空质粒 分子 IPTG
(3)将等量的从大肠杆菌中分离得到的LOX和从大豆中提取的LOX分别加入到适量的β-胡萝卜素溶液中，在相同环境下反应相同时间，观察β-胡萝卜素溶液的褪色情况
【分析】基因工程的操作步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）①在RT−PCR（逆转录PCR）过程中，需要逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶的催化，将mRNA逆转录成cDNA。根据题图中LOX基因序列、转录方向及表达载体结构可知，为了便于基因表达载体的构建，引物F1和R1应分别包含Kpn I和Aval酶切位点，因此引物F1为‌5′-GGTACCGTAGTGTTGGTGGGTTGG-3′，引物R1为5′-CTCGAGAAAGCCAAACATGAAAGC-3′，故引物F1和R1应分别为A和B。
（2）图中代表基因工程核心步骤的是②，即基因表达载体的构建。这一步是基因工程的关键，它涉及到将目的基因（LOX基因）与载体（如质粒）连接起来，形成重组质粒，以便于在大肠杆菌中表达目的基因。③过程是将重组质粒转化到大肠杆菌中，使其能够在大肠杆菌中复制并表达目的基因。为了利于重组质粒的转化，需要用Ca2+处理大肠杆菌，以利于重组质粒的转化。仅利用含氨苄青霉素的培养基无法区分含有目的基因（LOX基因）和空载体（只含有氨苄青霉素抗性基因，但没有目的基因）的大肠杆菌。因为这两种大肠杆菌都能在含氨苄青霉素的培养基上生长。因此，还需利用PCR等技术在分子水平上对大肠杆菌进行检测与筛选，以确定哪些大肠杆菌含有目的基因。筛选后的大肠杆菌用于生产时，除营养物质外，培养基中还需添加IPTG（异丙基-β−D-硫代半乳糖苷）。IPTG可以激活T7启动子，从而启动目的基因（LOX基因）的表达。
（3）要对利用基因工程生产的LOX进行活性鉴定，因此需要通过与天然的LOX进行对比来确定其活性，因为天然的LOX具有使β−胡萝卜素漂白褪色的特性，所以可以通过这一特性来鉴定生产的LOX是否具有活性。所以实验设计思路为：将等量的从大肠杆菌中分离得到的LOX和从大豆中提取的LOX分别加入到适量的β-胡萝卜素溶液中，在相同环境下反应相同时间，观察β-胡萝卜素溶液的褪色情况。如果β−胡萝卜素发生漂白褪色，则说明生产的LOX具有活性；如果β−胡萝卜素没有发生漂白褪色，则说明生产的LOX没有活性或活性很低。
18．（2025·辽宁沈阳·模拟预测）BMP15蛋白由卵母细胞分泌，在哺乳动物卵巢、卵泡的生长发育、成熟以及排卵过程中起着不可或缺的作用。科研人员克隆出新西兰白兔BMP15基因后，构建该基因的真核表达载体，并对产生的BMP15蛋白进行分析。相关实验过程如图1所示。请回答下列问题。
(1)选取幼龄健康的新西兰白兔雌兔，采集 组织的RNA，经①～③过程可获得大量的BMP15基因。①②过程中需要用到的酶分别是 。
(2)③过程中，添加的一种引物序列为5′—CGGAATTCGGATGGCCCTCTCAGCATCCT—3′，则下列序列中最有可能是另一种引物序列的是____。
A．5′-GGTGGTTGGTTGGGCTTTTCAATTCCCGCG-3′
B．5′-TCAGGACGTGTACAGCCACTCCATGGGGC-3′
C．5′-CGGGGTACCTCACCGACATGTGCAGGACT-3′
D．5′-AGGTACCTGAGGAGGGCCATCCGAATTCCG-3′
(3)图示重组载体pCMV-Myc-BMP15中，未标明的结构有 ，CMV启动子的作用是 。
(4)④步骤应将转化好的菌涂在含有 的培养基上，筛选获取菌落。若通过抗原—抗体杂交技术来检测融合Myc-tag标签的BMP15蛋白是否表达成功，一般需加入 。
(5)实验组将重组载体pCMV-Myc-BMP15转染到人胚肾细胞HEK293T内，对照组将 转染到相应受体细胞，收取细胞样品用于检测mRNA和蛋白质水平的表达效果。检测结果如图2（CON：对照组；OVE：重组质粒转染组）。
分析图示结果可知 。
(6)对不同物种BMP15基因进行核苷酸序列比较，得到下表，据表推测，兔与 的亲缘关系最近。
【答案】(1) 卵巢 逆转录酶、RNA水解酶
(2)C
(3) 复制原点、终止子 与RNA聚合酶结合，驱动BMP15基因和Myc-tag序列转录
(4) 氨苄青霉素 Myc抗体
(5) pCMV-Myc空载体 与对照组相比，BMP15基因mRNA水平和蛋白水平的表达效果均上升
(6)猪
【分析】PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术；PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶；同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。
【详解】（1）BMP15蛋白由卵母细胞分泌，所以应采集新西兰白兔卵巢组织的RNA，经RT-PCR过程获得大量的BMP15基因。图1中①是逆转录，需要逆转录酶，②是将cDNA上的RNA序列水解，需要RNA水解酶。
（2）利用PCR扩增目的基因时，需要在引物的5'端添加限制酶识别序列，便于将目的基因插入载体中，由图1可知，切割载体的限制酶识别序列是5’- GAATTC -3'和5'-GGTACC -3'，而添加的一种引物序列中含有序列5'- GAATTC -3’，则另一种引物序列的5'端需要含有序列5'-GGTACC -3'，C和D选项均满足该条件，但是D选项的引物序列中还含有序列5'- GAATTC - 3'，C正确，ABD错误C。
故选C。
（3）图示重组载体pCMV-Myc-BMP15中，未标明的结构有复制原点、终止子，CMV启动子的作用是与RNA聚合酶结合，驱动BMP15基因和Myc-tag序列转录。
（4）重组载体含有氨苄青霉素抗性基因，含有重组载体的大肠杆菌能够在含有氨苄青霉素的培养基中生长，所以④步骤应将转化好的菌涂在含有氨苄青霉素的培养基上进行筛选，获取菌落，没有转化的大肠杆菌不能形成菌落。可通过抗原-抗体杂交实验，加入Myc抗体来检测BMP15基因是否表达，因为BMP15基因与Myc基因形成融合基因，表达后形成融合蛋白，Myc表达即意味着BMP15基因表达。
（5）实验组将重组载体pCMV-Myc-BMP15转染到人胚肾细胞HEK293T内，对照组将pCMV-Myc空载体转染到相应受体细胞，收取细胞样品用于检测mRNA和蛋白质水平的表达效果。分析图示结果可知，与对照组相比，BMP15基因mRNA水平和蛋白水平的表达效果均上升。
（6）据表可知，与兔同源性最高的是猪(81.9%)，与兔变异度最低的也是猪(18.1%)，所以兔与猪的亲缘关系最近。
19．（2025·辽宁·模拟预测）基因工程中合理的利用启动子能起到调控基因表达的作用。当诱导物存在时，诱导型启动子可启动目的基因的表达。帕金森病（PD）严重威胁中老年人健康。神经节苷脂（GM1）是临床用于治疗PD的药物之一。猪脑中的GM1含量低，但合成GM1的原料GD（一种生物大分子）的含量较多，GD可在唾液酸酶的作用下生成GM1。研究人员将唾液酸酶的mRNA逆转录得到的M基因与质粒P构建成基因表达载体M—P，导入大肠杆菌中，以获得唾液酸酶高产菌株，用以满足工业化生产GM1的需求。图1为M基因两端的碱基对序列；图2为P质粒的结构示意图；图3为EcRI和BamHI两种限制酶的识别序列和酶切位点。
(1)图2质粒P的结构中，四环素抗性基因的功能是 。
(2)M基因以a链为模板链进行转录，利用PCR技术扩增M基因时，需依据图1、图3中的已知碱基序列等信息设计引物，设计的两引物碱基序列为5'- -3'（写出10个碱基）和5'- -3'（写出10个碱基）。
(3)对受体菌进行分子水平的检测，发现存在M基因；继续在培养基中加入GD，但是却检测不到M基因相应的mRNA，原因是 。为了解决上述问题，可以使用 （“基因工程育种”或“诱变育种”或“杂交育种”）技术获得新品种，从而得到唾液酸酶高产菌株。
【答案】(1)作为标记基因，便于对导入基因表达载体的受体细胞进行筛选（答案合理即可）
(2) GAATTCCTAG GGATCCATGG（两空可以互换）
(3) 细胞膜具有选择透过性，GD是生物大分子，不能进入细胞，无法和启动子结合，不能驱动M基因的转录，不能形成M基因相应的mRNA。 基因工程育种
【分析】基因工程的基本操作程序是：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）图2质粒P的结构中，四环素抗性基因作为标记基因，其功能是便于对导入基因表达载体的受体细胞进行筛选。
（2）M基因以a链为模板链进行转录，基因转录时从模板链的3'开始。结合质粒中启动子的方向可知，目的基因a链3′端连接启动子，5′端连接终止子，为了能使扩增后的目的基因与质粒正向连接，需要在目的基因的左右两侧分别添加限制酶BamHⅠ和EcRⅠ的识别序列，所以需要在PCR扩增仪中加入的引物序列为5'-GAATTCCTAG-3'和5'-GGATCCATGG-3'。
（3）当诱导物存在时，诱导型启动子可启动目的基因的表达。基因的表达过程包括转录和翻译，mRNA是转录的产物。对受体菌进行分子水平的检测，发现存在M基因；继续在培养基中加入GD，但是却检测不到M基因相应的mRNA，说明导入受体菌的M基因没有进行转录，究其原因是：细胞膜具有选择透过性，GD是生物大分子，不能进入细胞，无法和启动子结合，不能驱动M基因的转录，不能形成M基因相应的mRNA。大肠杆菌不进行有性生死，无法进行杂交育种。大肠杆菌没有相应的唾液酸酶合成的相关基因，不能进行诱变育种。因此，为了解决上述问题，可以使用基因工程育种技术获得新品种，从而得到唾液酸酶高产菌株。
20．（2025·辽宁·模拟预测）在冷冻胁迫中草本植物的细胞膜是首先受到伤害的部位，细胞膜的不可逆伤害是造成冻害的主要原因。SAD（硬脂酰基载体蛋白脱氢酶）基因是调控植物抗冻性的基因之一，是不饱和脂肪酸合成途径中的关键脱氢酶基因。利用脱氢酶将适量的不饱和键引入脂肪酸中，能有效降低冷冻伤害，使膜具有必要的流动性，维持生物膜的正常功能。现利用基因工程技术培育抗冻马铃薯。回答下列问题。
注：图1中A、F、B、R为引物，图2中P为启动子，T为终止子，ri为复制原点，YGFP为黄绿色荧光蛋白基因，HygBR为潮霉素抗性基因，马铃薯在自然状态下不具有潮霉素抗性。
(1)SAD基因可从已知结构和功能清晰的基因中筛选，也可从 中检索相关序列信息。为使SAD基因与载体正确连接，对SAD基因进行PCR扩增时，应选择引物 ，在其对应5’端分别添加限制酶 的识别序列。
(2)将构建成功的表达载体导入农杆菌，与马铃薯叶片共培养，利用T-DNA 的特点，可将SAD基因导入马铃薯叶片细胞。
(3)为探究转化过程中农杆菌侵染时间与转化效率之间的关系，以马铃薯栽培种（De）和野生种（Sc）1cm左右茎段作为受体材料进行了研究。在马铃薯与农杆菌共培养的培养基中添加 ，用于筛选被侵染的马铃薯茎段。将筛选出的马铃薯茎段转移至再生培养基2周后，使用365nm紫外光手电筒照射， （填“阳性”或“阴性”）转化茎段会呈现黄绿色荧光，否则茎段为红色，观察荧光，并进行记录，计算出不同侵染时间下的转化效率（荧光外植体数量/外植体总数量×100%），如图3、4。结果表明 。
(4)在一定程度上，植物的抗冻性随着细胞膜中不饱和脂肪酸含量增加 。从个体生物学水平，鉴定转SAD基因马铃薯培育是否成功的方法是 。
【答案】(1) 序列数据库（GenBank） F和R XbaI、SmaI
(2)能转移到被侵染细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上
(3) 潮霉素 阳性 不同侵染时间的转化效率有较大差异，不同的受体材料转化效率也具有差异性（或De的侵染时间为40min时，转化效率最高，Sc的侵染时间为20min时，转化效率最高）
(4) 增强 取等量转基因和非转基因马铃薯植株，种植在低温环境下一段时间，观察并比较它们的生长发育情况
【分析】培育转SAD基因马铃薯主要需要4个步骤：目的基因的筛选与获取，基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）SAD基因的筛选，可以从结构和功能清晰的基因中进行筛选，也可以从序列数据库（GenBank）中检索相关序列信息。SAD基因的获取，可以采用PCR的方法。对SAD基因进行PCR扩增时，引物与模板链的3'端相结合，引导子链5'端到3'端方向形成。SAD基因转录的方向是从右向左，因此上面的那条链是它的模板链，F端为上游引物，R端为下游引物。载体中P为启动子，T为终止子，在P和T之间有4个限制酶切割位点，EcRI不可以使用，会破坏YGFP基因和终止子，BamHI具有2个切割位点，也不可以使用，因此选择XbaI和Smal，F端添加XbaI限制酶识别序列，R端添加SmaI识别序列，可以保证SAD基因与载体的正确连接。
（2）将目的基因导入受体细胞，选择农杆菌转化法。在与马铃薯叶片共培养时，农杆菌的Ti质粒上的T-DNA可以进入到被侵染的细胞，并整合到受体细胞染色体DNA上，这样可以将SAD基因导入马铃薯叶片细胞。
（3）自然状态下，马铃薯不具有潮霉素抗性，农杆菌侵染失败的马铃薯茎段在添加潮霉素的培养基中无法存活。Ti质粒上的潮霉素抗性基因可作为标记基因，用于农杆菌侵染成功马铃薯茎段的筛选。侵染成功后，T-DNA可能整合到受体细胞染色体DNA上，也可能整合失败，因此，再生培养2周后，通过365nm紫外光手电筒照射，阳性转化的外植体会呈现黄绿色荧光（YGFP基因表达的效果），否则茎段为红色，观察荧光并进行记录，计算不同侵染时间下的转化效率。由图3、4可知，不同侵染时间的转化效率是有很大的差异的，而不同的受体材料也是具有差异性。或者，De的侵染时间为40min时，转化效率最高，Sc的侵染时间为20min时，转化效率最高。
（4）利用脱氢酶将适量的不饱和键引入脂肪酸中，能有效降低冷冻伤害，使膜具有必要的流动性，维持生物膜的正常运行。因此，在一定程度上，植物的抗寒性随着细胞膜中不饱和脂肪酸含量的增加而增强。从个体生物学水平鉴定转SAD基因马铃薯培育是否成功的方法是：取等量转基因和非转基因马铃薯植株，分别种植在低温环境下一段时间，观察并比较二者的生长发育情况。
考点
五年考情（2021-2025）
命题趋势
考点1 发酵工程
2024·辽宁、吉林、黑龙江
2023·辽宁
2022·辽宁（2道选择）
从近五年辽宁省高考试题来看，常出现的考点是发酵工程和细胞工程、基因工程，发酵工程和细胞工程难度适中，基因工程非选择题难度较大。发酵工程和细胞工程常以选择题的形式考察、每年一道或2道、基因工程是高频考点，每年选择非选择都有考察。
考点2 细胞工程和胚胎工程
2024·辽宁、吉林、黑龙江
2023·辽宁
2022·辽宁（1道选择、1道非选择）
考点3 基因工程
2024·辽宁、吉林、黑龙江（1道选择、1道非选择）
2023·辽宁（1道选择、1道非选择）
2022·辽宁
名称
识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
HindⅢ
A↓AGCTT
TTCGA↑A
EcRI
G↓AATTC
CTTAA↑G
PvitⅡ
CAG↓CTG
GTC↑GAC
PstI
CTGC↓AG
GA↑CGTC
KpnI
G↓GTACC
CCATG↑G
BamHI
G↓GATCC
CCTAG↑G
比较项目
同源性（%）
兔
马
猪
绵羊
鸡
变异度（%）
兔
81.2
81.9
79.9
38.3
兔
马
18.8
82.2
84.5
38
马
猪
18.1
18.1
87
38.6
猪
绵羊
19.2
16.5
13.4
39.7
绵羊
鸡
88.5
90.3
92.6
86.4
鸡
兔
马
猪
绵羊
鸡