苏教版 (2019)选择性必修3 生物技术与工程第二节 发酵工程的无菌技术课文内容课件ppt

这是一份苏教版 (2019)选择性必修3 生物技术与工程第二节 发酵工程的无菌技术课文内容课件ppt，共48页。
平板划线法分离和纯化微生物
由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。
（1）酵母菌①酵母菌是 真菌，可以进行 生殖，也可以进 生殖；②培养的最适pH为 ，最适生长温度为 ；③可以用液体培养基培养，也可以用固体培养基培养，但要获得纯化的酵母菌菌落，则需要通过 培养基培养。
走进实验室：通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落
（2）实验目的尝试通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落。（3）实验原理① 培养基能满足酵母菌生长、繁殖的营养需要；② 是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法之一。
（4）实验器材和试剂酵母菌样本（菌种）；接种环、酒精灯、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅；马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml（调pH）。
将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为103kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15-20min。将5-8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160-170℃灭菌2h（也可在高压蒸汽灭菌锅中一起灭菌）。
待培养基冷却至50左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
倒平板注意事项：①温度：50℃左右②操作：在酒精灯火焰附近③冷凝后平板倒置
2.将瓶口迅速通过火焰2~3次，并转动瓶口，确保瓶口灭菌
3.用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10-20mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖
4.等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒转过来放置
1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。
2.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
最好不要用这个平板培养微生物。 防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。
4.怎么确定所倒平板未被杂菌污染？
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
因为平板凝固后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，又可避免培养基中的水分过快蒸发。
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养可以分离得到单菌落。
1、概念：是指把含有多种微生物的 样品，通过在特定的琼脂平板表面 ，从而获得 的方法。2、具体做法：将微生物样品在琼脂平板表面多次做“ ”的稀释划线，经过这样的操作可得到较多独立分布的 微生物。
接种划线时，将带有酉孝母菌样品的接种环，在培养皿内培养基的 区域划线，然后再从第l区域划到 区域,从第2区域划到第3 区或（在第2次、第3 次划线前，接种环需 ）在固体培养基表面完成多次“ ”的逐步稀释。划完线后盖上皿盖， 培养。注:接种和划线操作需要在酒精灯火焰附近进行
在一个倒有培养基的 外侧面中央用记号笔画一直线,再在此线中间处画一垂直线,将培养分成三个区域：第1区域、第2区域、第3区域，分别标上“1”“2”“3”字样
通过培养可以得到由单个酵母菌增殖而形成的 。
1、将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。
2、在火焰旁冷却接种环，并拔出装有酵母菌的棉塞
3、将试管口通过火焰
.4、将已冷却的接种环伸入菌液中，蘸取一环菌液
5、将试管通过火焰，并塞上棉塞
6、左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基
7、灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连
8、将平板倒置放入培养箱中培养。
划3个平板（重复实验）1个不划线（空白对照）
1）一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；2）存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。
①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次②划线首尾不能相接③每次划线前接种环进行灭菌④划线后,培养皿倒置培养
为什么要同时放入未接种的平板？
既可以防止培养基表面的水分挥发；又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染
作对照，该培养皿无菌落说明培养基没有污染
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养24-48 h。
（6）结果与分析①酵母菌被纯化的标准：培养24 h后，在划线的 出现 的单个菌落。②纯化失败的原因a.接种环灭菌后未 直接在斜面上挑取菌体，菌体可能因为接触高温接种环而 。b.第一次划线前挑取的菌体 ，则也有可能无法获得由一个酵母菌形成的单个菌落。
1.平板划线法接种菌种时，哪些操作可防止杂菌污染？
（1）接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧。（2）划线操作在酒精灯火焰旁进行。（3）接种环挑取菌体前后，要将试管口通过火焰。（4）划线时将培养皿的皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划线，划线后及时盖上皿盖。
2.在琼脂平板表面多次做“由点到线”的稀释划线的目的是什么？
这样做可以得到较多独立分布的单个微生物增殖而成的菌落。
3.接种操作完成后，需将平板倒置放入培养箱中培养，此时倒置的目的是什么？
防止水分过快挥发，防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
4.若在培养基上观察到不同形态的菌落，原因是什么？
原因可能是菌种不纯，混入其他杂菌，或在实验操作过程中被杂菌污染。
（1）倒平板后，待平板冷凝之后需将其倒置（　　）（2）若皿盖和皿底之间溅上培养基，这个培养基不可再用（　　）（3）平板划线法接种时，每一次划线前都要挑取菌体（　　）（4）培养微生物的温度因菌种不同而稍有差异（　　）
1.配制培养基的注意事项（1）如果需要调节培养基的pH，应该在定容完成后，灭菌之前进行操作。（2）培养基灭菌后要冷却到50 ℃左右时开始倒平板。其原因是琼脂是一种多糖，在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固，倒平板时高于50 ℃会烫手，低于50 ℃时，若不及时操作，琼脂会凝固。（3）倒平板时，要使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰2～3次。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
（4）平板冷却凝固后，要将平板倒置。因为平板凝固后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，又可避免培养基中的水分过快蒸发。（5）在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，那么这个平板不能用来培养微生物，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
2.平板划线操作中三种灼烧的目的不同
3.实验结果的分析（1）培养未接种的培养基的目的是检查培养基制备是否合格。未接种的培养基表面若有菌落生长，则说明培养基被污染，应该重新制备；若无菌落生长，则说明未被污染。（2）在接种酵母菌的培养基上可观察到独立的菌落，这些菌落在颜色、形状和大小上相似，酵母菌菌落一般表面光滑，多呈乳白色。（3）若在培养基中观察到不同形态的菌落，原因可能是菌液不纯，混入其他杂菌，或在实验操作过程中被杂菌污染。
1.下列关于倒平板的叙述，错误的是A.待培养基冷却至50 ℃左右时倒平板B.倒平板整个过程应在酒精灯火焰旁进行C.完全打开培养皿皿盖，右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿，左手立 即盖上培养皿的皿盖D.为避免水滴滴入培养基，平板应倒过来放置
2.（2021·江苏苏州月考）微生物接种的方法很多，平板划线法是常用的一种。如图是平板划线示意图，划线的顺序为①②③④。下列相关叙述错误的是A.划线操作时，将挑有菌体的接种环插入培养基B.平板划线后培养微生物时要倒置培养C.不能将第④次的划线与第①次的划线相连D.在第②～④次划线前都要对接种环进行灭菌
稀释涂布平板法分离和纯化微生物
1.具体做法：将待分离的材料做一系列的 ，再取一定量的某一稀释度的菌液 ，然后用无菌的 将菌液均匀地涂布在整个平板表面，使其中的微生物 分散，培养后在平板培养基表面形成多个单菌落。2.应用：既可用于菌种的 ，也可以用于微生物的 。3.混合平板法：将稀释的少量菌悬液与 左右的培养基混合均匀后倒入无菌培养皿中，再将培养皿置于合适温度下培养，这样在培养基表面和内部均可长出 。（4）平板划线法的缺点是不能 ，而 则能用于微生物的计数。（5）计数依据：如果经稀释涂布平板法培养出的都是 增殖形成的菌落，那么统计这些 的数目，即可计算出单位体积样品中的微生物数量。
（1）将分别盛有9mL水的试管灭菌并编号。
（2）用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第二支试管中，轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。
（3）从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复步骤2，直到第六支试管。
注意：移液管需要经过灭菌，试管口和移液管应在离火焰1-2cm处
稀释涂布平板法的操作过程——系列稀释操作
①取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
②将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
③将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，培养
稀释涂布平板法的操作过程——涂布平板操作
常用微生物分离方法比较
1.实验目的①学会配制选择培养基，以分离出能分解尿素的细菌。②学会采用 分离和培养分解尿素的细菌，并进行计数。2.实验原理①利用 培养基可以筛选和分离某种微生物。②在 的条件下，于固体培养基上培养该微生物，形成 菌落。单个菌落即为 ，通过对菌落数量的统计，可以计算出样品中的含菌数。（3）实验器材和试剂①土壤样品。②灭菌处理过的各种工具。③配制以 为氮源的1 000 mL选择培养基的试剂以及调节pH的相关试剂。
走进实验室：分离土壤中分解尿素的细菌并进行计数
（1）选取土样——取样部位:表层以下 cm的土壤约10 g（2）制备土壤悬液——称取1g土壤，倒入99mL的无菌水，制备土壤悬液。用 进行梯度稀释
①铲取土样，将样品装入纸袋中
取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌
②取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
（3）配置培养基及制作平板
设置一组不加 的平板，作为空白对照
在大烧杯加入培养基的成分，并加琼脂煮沸溶解，定容，调节pH为7.2～7.4，装入锥形瓶，灭菌，冷却至50℃，倒平板。
（4）涂布——从浓度 的土壤悬液开始，每个浓度设置 个重复
接种在牛肉膏蛋白胨培养基 （完全培养基），观察菌落的差异
思考:若要判断选择培养基是否具有选择作用，应如何设计对照?
（5）培养与观察
计算时，选取菌落数为 的一组为样本进行统计
公式:每克土壤样品的细菌数=某一稀释度几次重复培养后的菌落平均数× 倍数÷涂布所用稀释液 数
另设一组对照，用等体积 代替土壤悬液，用来判断平板在实验前或实验过程中是否被 。
________于37℃恒温箱中培养1~2d；每 h观察一次
5.结果与分析：菌落数目在30～300的一组平板上一般可以获得单个分解尿素的细菌菌落。
一般统计的菌落数比活菌的实际数目低，为什么？
因为当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
计数方法显微镜直接计数法：是一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法。统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。
【例1】某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL） （ ） ×108 ×109 C.234 D.23.4
例2、如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析正确的是（　　）A．3号试管的稀释倍数为103倍B．5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109个C．5号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数恰为4号试管的10倍D．该方法和平板划线法都可对微生物进行准确计数
（1）稀释涂布平板法能分离细菌，也能计数（　　）（2）测定不同微生物数量时，接种的土壤悬液的稀释度相同（　　）（3）采用稀释涂布平板法培养和计算得到的微生物的数量一般比稀释液中实际微生物的数量要少（　　）
甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。1.甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果 （填“可靠”或“不可靠”），若不可靠，应如何改进？
为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值。
2.乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理 （填“合理”或“不合理”）。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应 ，找出差异的原因，而不能简单地将结果舍弃后进行计数。
分析实验过程中可能的影响因素
3.某同学在三种稀释度下吸取0.1 mL的菌液涂布平板，统计菌落数，得到以下的数据，试计算1 g样品的活菌数。
105的稀释度下取0.1 mL的菌液涂布的三个平板上的菌落数在30～300之间，计算其平均值为（212＋234＋287）/3≈244。进一步可以换算出1 g样品中活菌数为244×105÷0.1＝2.44×108（个）。
1.分离尿素分解菌操作中的注意事项（1）在实验操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。（2）样品稀释液的最佳浓度为培养后每个平板上有30～300个菌落的浓度。（3）每一稀释倍数的菌液都至少要涂布3个平板，作为重复实验，求其平均值，若其中有菌落数与其他平板差别很大的，则需要重新实验。
2.试比较两种分离和纯化方法
3.用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中得到以下几种统计结果，其中正确的是A.涂布了1个平板，统计的菌落数是230B.涂布了2个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238C.涂布了3个平板，统计的菌落数分别是13、234和254，取平均值167D.涂布了3个平板，统计的菌落数分别为210、240和250，取平均值233
4.分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是①加尿素　②不加尿素　③加琼脂　④不加琼脂　⑤加葡萄糖　⑥不加葡萄糖　⑦加硝酸盐　⑧不加硝酸盐A.①③⑤⑦ B.②④⑥⑧C.①③⑤⑧ D.①④⑥⑦