2025年高考生物二轮复习：基因工程 热点拓展讲义

这是一份2025年高考生物二轮复习：基因工程 热点拓展讲义，共15页。学案主要包含了DNA样品准备，DNA电泳分离，DNA变性和转膜，DNA固定，探针标记与杂交，洗膜与检测等内容，欢迎下载使用。
热点拓展点
热点拓展一 同尾酶
1．同尾酶定义
同尾酶，即能切割产生相同末端的限制酶，一般是指能产生相同黏性末端的限制酶。所有平末端酶产生的末端均是相同的，但一般不把它作为同尾酶来研究。同尾酶是不同的酶，它们只是切割DNA产生的末端相同，同尾酶之间的识别序列可以相同也可以不同，但基因工程中识别序列不同的同尾酶的应用性最大。在构建基因表达载体的过程中，若选择的某种限制酶会破坏目的基因或质粒的重要片段时，可尝试使用该酶的同尾酶进行切割。
2．同尾酶作用特点
同尾酶产生的黏性末端虽然可以像完全亲和的黏性末端那样进行连接，但是它与完全亲和的黏性末端连接不同的是，连接后的产物往往失去原有的限制性内切核酸酶的切点，但是，少数情况下，也有能被某一种同尾酶识别并切割。例如，由BamHⅠ和Sau3AⅠ识别和切割序列分别是5′- eq \(GG,\s\up6(↓))ATCC-3′和5′ eq \(­G,\s\up6(↓))ATC-3′，切割重组后，不能被BamHⅠ识别和切割，但仍能被Sau3AⅠ识别和切割。
这样用同尾酶进行体外重组时，在限制酶切割反应之后不必将原有的限制酶失活，就可直接进行重组连接。由于连接体系中原有的限制酶的存在，从而保证了载体同外源DNA的连接。所以在这种连接反应中不必用碱性磷酸酶进行载体的脱磷酸反应而得到最高的连接效率，即不需要将5′端突出的磷酸基团消化掉，使质粒载体自身不能形成闭合的环状结构。
热点拓展二 启动子与转录调控
1．启动子的类型
启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游，启动子本身不被转录。
启动子对转录起始有调节和控制作用，决定着基因表达过程的起始以及在什么条件下开始。
参照转录调控模式，启动子又可以分：
（1）组成型启动子，该类启动子能够调控结构基因的表达基本恒定在一定程度上，在不同部位或组织表达水平差异不明显。
（2）组织特异型启动子，该类启动子的调控作用使得基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，且表现出发育调节的特性。如构建乳腺生物反应器使用的即为乳腺细胞中特异表达基因的启动子。
（3）诱导型启动子，即在某些特定的物理或化学信号刺激后，基因转录水平在该类型启动子调控下大幅度地提升。目前已经分离了众多启动子如热诱导表达基因、光诱导表达基因、创伤诱导表达基因、真菌诱导表达基因和共生细菌诱导表达基因启动子等。
2．启动子位置及转录模板链的判断
基于图1中的信息能否判断启动子位置及转录模板链？答案是否定的，若要对转录情况做出准确判断，必须要明确以下三个要素：
（1）链方向
（2）链性质（编码链或模板链）
（3）功能区域（启动子或终止子）
确定其中2个要素即可确定第3个要素。
举例分析如下：
①基于图2中模板链①及其方向，判断启动子的位置。
由于转录产生的RNA新链的合成方向为5′→3′，转录过程的发生是从启动子到终止子，则推导出非编码区2为启动子。
②基于图3中启动子位置及DNA链的方向，判断模板链位置。
转录过程的发生是从启动子到终止子，转录产生的RNA新链的合成方向为5′→3′，且与模板链反向平行，推导出②为该基因的模板链。
③基于图4中的模板链（①）及启动子位置，判断DNA链的方向。
转录过程的发生是从启动子到终止子，转录出来的mRNA的5′端位于左侧，3′端位于右侧，由于①为模板链，其与转录产生的mRNA互补，且反向平行，所以①的方向从左至右为3′→5′，②的方向从左至右为5′→3′。
热点拓展三 Suthern印迹杂交
Suthern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的方法。其原理为利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链 DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的放射性同位素标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。Suthern印迹杂交实验可以帮助研究人员检测特定DNA序列的存在和数量，可应用于基因表达研究、基因组学、医学诊断等领域。
实验操作步骤如下：
一、DNA样品准备：从组织或细胞中提取基因组DNA，使用一种或多种限制酶对基因组DNA进行切割，将其消化成大小不同的片段。
二、DNA电泳分离：制备琼脂糖凝胶，在恒定电压下，将切割后的DNA片段上样至琼脂糖凝胶中，进行电泳分离。电泳时间根据DNA片段的大小和凝胶浓度而定，以确保DNA片段按分子量大小在凝胶中形成清晰的条带。
三、DNA变性和转膜：将电泳后的凝胶浸泡在变性溶液中（如0.25 ml/L HCl和碱性溶液），使DNA变性并断裂成单链片段。将变性后的凝胶上的DNA片段转移到固相支持物上，如硝酸纤维素膜或尼龙膜。在转膜过程中，需要保持DNA片段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置一致。
四、DNA固定：将载有DNA片段的膜进行固定处理，以防止DNA在后续步骤中脱落。常用的固定方法有紫外线照射或干烤等。
五、探针标记与杂交：使用同位素（如放射性同位素）或非同位素（如地高辛）标记方法制备特异性探针。将固定好的膜置于预杂交液中，将标记好的探针加入预杂交液中，与膜上的DNA片段进行杂交反应。
六、洗膜与检测：洗去未与DNA片段结合的游离探针。根据探针的标记方法选择合适的检测方法。对于放射性同位素标记的探针，通常采用放射自显影进行检测；对于非同位素标记的探针，则可以使用相应的显色系统（如地高辛特异抗体检测系统）进行检测。
热点拓展四 PCR技术拓展
1．实时荧光定量RT-PCR技术检测病毒核酸
病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针（一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合）。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被耐高温的DNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到（如图甲），通过实时荧光PCR检测某冠状病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图乙，荧光到达预先设定阈值的循环数（Ct值）越小，说明病毒核酸浓度越高。

2．PCR定点突变——重叠延伸PCR技术
重叠延伸PCR技术其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物（图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点），分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。如某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺（密码子为AAC、AAU）替换为赖氨酸（密码子为AAA、AAG），从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图：
3．PCR定点突变——大引物PCR技术
大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。原理如图。
4．反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列
当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理：用限制酶消化该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。原理如图。
5．巢式PCR
首先将目标的DNA模板与第一套引物（外引物）结合。第一套引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片段（图中未显示可能的多种产物）。然后使用第二套引物（内引物）对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片段包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片段。这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。原理如图。
2．(2024·广东湛江二模）研究发现，若将第52位的脯氨酸（密码子为CCA）替换成苏氨酸（密码子为ACA），则可增强抗菌肽的抑菌性。抗菌肽基因的部分碱基序列及可供选择的引物如图1所示，箭头下方的数字代表碱基序号。现利用重叠延伸PCR技术对抗菌肽基因进行改造以获得抑菌性更强的抗菌肽，过程如图2所示，其中Ⅰ为转录模板链，引物上的“”代表突变位点。改造过程中PCR2所使用的引物组合为（ ）
A．引物1和引物4 B．引物2和引物6
C．引物2和引物4 D．引物3和引物5
热点拓展五 基因组编辑技术
1．寡核苷酸介导的定点突变
寡核苷酸是一类只有20个以下碱基的短链核苷酸的总称，利用寡核苷酸可以实现不依赖PCR的定点突变。
（1）首先人工合成一段含有特定突变位点的单链寡核苷酸片段（除突变位点外，该片段的其他部分可以与目的基因互补配对）。
（2）然后将该寡核苷酸片段与带有目的基因的单链载体（通常由M13噬菌体衍生而来，内有一个环状单链DNA分子）进行杂交。
（3）继而在DNA聚合酶和DNA连接酶的作用下分别进行DNA链的合成和连接反应，得到含有突变位点的双链载体。
（4）最后将双链载体引入宿主细胞复制，并进行筛选和鉴定。
2．CRISPR/Cas9系统
CRISPR/Cas系统是细菌和古菌在长期演化过程中形成的一种免疫系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵，为它们提供获得性免疫。CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达。正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas系统已被开发成一种高效的基因组编辑工具。其中最常见的是CRISPR/Cas9基因编辑技术。
（1）系统构成：向导RNA＋限制性内切核酸酶Cas9。由具有内切核酸酶功能的Cas9蛋白和一条人为重组的一段目的基因的单链向导RNA(SgRNA）组成，向导RNA可以指导Cas9蛋白对靶基因进行敲除、插入和突变修饰。
（2）编辑原理：向导RNA能与基因组DNA中特定碱基序列通过碱基互补配对结合在一起，引导Cas9到特定的基因位点进行切割；通过设计向导RNA中的20个碱基的识别序列，可人为选择DNA上的目标位点进行切割。根据CRISPR/Cas9精准攻击外源DNA的工作原理，就可以实现基因敲除。如果在此基础上为细胞引入一个修复的模板质粒（供体DNA分子），就可以实现基因的定点突变。
3．重叠延伸PCR技术、大引物PCR技术（见热点拓展四）
课堂学习任务
热点拓展一 同尾酶
1.(2024·湖南雅礼中学模拟）像BclⅠ(- eq \(TG,\s\up6(↓))ATCA-)、BglⅡ(- eq \(AG,\s\up6(↓))ATCT-)、MbⅠ( eq \(­G,\s\up6(↓))A）C-)这样，识别序列不同，但能产生相同的黏性末端的一类限制酶被称为同尾酶。如图表示目的基因及质粒上的酶切位点。选用不同的限制酶对质粒和目的基因进行切割，并用DNA连接酶进行连接。下列分析错（的是） )
热点拓展二 启动子与转录调控
1.(2023·山东卷）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
（1）与图甲中启动子结合的酶是____________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有_________________________________________________
_____________________________________________________________________（答出2个结构即可）。
（2）构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅
用一对引物，应选择图甲中的引物________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的________（填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。
（3）重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了____________________，条带2所检出的蛋白________（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。
热点拓展三 Suthern印迹杂交
1.(2024·湖南常德模拟）Suthern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。其基本方法是利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制酶消化的DNA片段，将凝胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至硝酸纤维素膜上并固定，再与放射性标记的探针进行杂交，利用放射自显影检测特定DNA分子。根据信息判断，下列说法中错误的是（ ）
A．限制酶消化DNA片段时破坏了相邻两个核苷酸分子之间的磷酸二酯键
B．转移至硝酸纤维素膜上的DNA片段中有2个游离的磷酸基团
C．标记探针与硝酸纤维素膜上的DNA分子部分碱基序列互补
D．可用Suthern印迹杂交法从基因组文库中获取目的基因
热点拓展四 PCR技术拓展
1．(2024·黑龙江大庆模拟）常规PCR只能扩增两引物间的DNA区段，要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．酶切阶段，L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列
B．环化阶段，可选E．cli DNA连接酶而不能选T4 DNA连接酶
C．应选择引物2和引物3进行PCR，且二者之间不能互补配对
D．PCR扩增，每轮循环前应加入限制酶将环状DNA切割成线状
热点拓展五 基因组编辑技术
1．定点突变技术是按照预定设计，对某个已知基因的特定碱基进行定点增删或转换，最终改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构。其中一种方法是利用寡核苷酸链介导的定点突变，过程如图所示。下列关于利用寡核苷酸链介导的定点突变技术的叙述，错误的是（ ）
A．该技术的原理是基因发生碱基对的替换
B．过程①需要模板、原料、能量、酶等基本条件
C．过程②以寡核苷酸链延伸后的单链为模板
D．过程①②均遵循碱基互补配对原则
2．(2021·海南卷）CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA(SgRNA）引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。
回答下列问题。
（1）过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定SgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是________________________________________。
（2）过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是_______________________。
（3）过程③～⑤中，SgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是_________________
_______。随后，Cas9蛋白可切割________序列。
（4）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1 200 bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是________________，基因敲除成功的判断依据是_________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
（5）某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入基因组DNA的编辑过程：____________________________________________________
__________________________________________________________________________________________________________________________________________。
答案解析
热点拓展一 拓展应用
B [切割质粒和切割目的基因均用BclⅠ和BglⅡ，由于两种酶切割后产生的黏性末端相同，形成重组质粒时目的基因可能反向连接，形成的碱基排列顺序不一定相同，A正确。切割质粒用BclⅠ和BglⅡ，切割后产生的黏性末端相同，切割后的质粒可能自我环化；切割目的基因用MbⅠ，切割后产生黏性末端，切割后的目的基因可以自我环化，B错误。切割质粒用MbⅠ，产生黏性末端，切割目的基因用BclⅠ和BglⅡ，产生黏性末端，形成的重组质粒中原来的BclⅠ和BglⅡ的切割位点的序列可能发生改变，不能再被这两种酶切割，但不影响MbⅠ的作用，C正确。切割质粒用MbⅠ，切割目的基因用MbⅠ，产生的均为黏性末端，切割后的质粒可自我环化，切割后的目的基因也可以自我环化，D正确]
热点拓展二 拓展应用
(1)RNA聚合酶 限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等 (2)F2和R1（或F1和R2） a链 (3)J-V5融合蛋白 不是
热点拓展三 拓展应用
B [限制酶切割DNA分子内部核苷酸分子之间的磷酸二酯键，A正确；转移至硝酸纤维素膜上的DNA片段是单链DNA分子，其中有1 个游离的磷酸基团，B错误；核酸探针通过氢键与待检测基因片段进行连接，进行碱基互补配对，C正确；放射性标记的探针进行杂交，利用放射自显影检测特定DNA分子，可用 Suthern印迹杂交法从基因组文库中获取目的基因，D正确]
热点拓展四 拓展应用
1．A [在酶切阶段，已知序列L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列，不然会将已知序列L切断，造成序列识别混乱，A正确；T4 DNA连接酶或E．cli DNA连接酶都可以用来连接黏性末端，因此环化阶段，可选用E．cli DNA连接酶或T4 DNA连接酶，B错误；PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合，为保证延伸的是已知序列两侧的未知序列，应该选择引物1和引物4，且二者之间不能互补配对，C错误；PCR的扩增只需要第一次循环前加入足够的限制酶，并不需要每轮都加入，D错误]
2．B [题图可知，利用重叠延伸PCR技术对DNA分子进行定点突变的过程中，通过PCR2获得产物CD时所用的引物组合为引物c、d。引物d与转录模板链的3′端结合，因此引物d的序列为5′-GTCACGTG，引物2符合该序列。现要利用重叠延伸PCR技术对抗菌肽基因进行改造以获得抑菌性更强的抗菌肽，则需要将第52位的脯氨酸替换成苏氨酸。根据两种氨基酸的密码子可知，需要将mRNA上的第154号碱基由C替换为A，则需要将DNA非转录模板链上对应部分的碱基由C 替换为A。因此引物c的碱基序列为5′-CCTGTTAT，引物6符合该序列。综上所述，B符合题意，A、C、D不符合题意]
热点拓展五 拓展应用
1．A [定点突变改变特定位点的核苷酸，先是诱变寡核苷酸引物上的碱基对发生替换、增添或缺失，随后经过延伸和复制，产生新的突变基因，A错误；该延伸过程属于DNA复制过程，需要模板、原料、能量、酶等基本条件，B正确；题图显示过程②为以寡核苷酸链延伸后的单链为模板合成互补DNA链的过程，C正确；延伸过程遵循碱基互补配对的原则，需要DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸，D正确]
2．(1)DNA连接酶 (2)Ca2+处理法 (3）碱基互补配对 目标（目的）DNA（基因） (4)DNA分子杂交技术 经编辑过的DNA片段（从受体细胞中提取的基因组DNA）与标记的目标（对应）基因（探针）杂交，若无杂交带，则敲除成功 (5）表达的Cas9蛋白和SgRNA，两者形成复合体，SgRNA识别并结合目标DNA序列，引导Cas9蛋白切割目标DNA序列
选项
切割质粒
切割目的
基因
结果分析
A
BclⅠ和
BglⅡ
BclⅠ和
BglⅡ
形成的重组质粒的碱基排列顺序不一定相同
B
BclⅠ和
BglⅡ
MbⅠ
切割后的质粒不可自我环化，切割后的目的基因可以自我环化
C
MbⅠ
BclⅠ和
BglⅡ
形成的重组质粒可被MbⅠ 再次切开，但可能无法被BclⅠ和BglⅡ再次切开
D
MbⅠ
MbⅠ
切割后的质粒可以自我环化，切割后的目的基因也可以自我环化