高中生物人教版 (2019)选择性必修3重组DNA技术的基本工具教学ppt课件

这是一份高中生物人教版 (2019)选择性必修3重组DNA技术的基本工具教学ppt课件，共47页。PPT课件主要包含了基因工程，情境导入，课堂小结，探究新知，课堂练习，缺口怎么办等内容，欢迎下载使用。
我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。
如何能培育出自身就能抵抗虫害 的棉花新品种呢？
将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因 转入普通棉花
按照人们的愿望，通过转基因等技术赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在 DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组 DNA 技术。
创造出人类需要的新的生物类型和生物产品
定向改造生物遗传特性；克服远缘杂交不亲和障碍
1.为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
2.为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
DNA分子的组成、空间结构和碱基互补 配对方式相同。（四种脱氧核苷酸、规则的双螺旋结构）
生物界共用同一套遗传密码。（都遵循中心法则）
基因工程诞生的理论基础
科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，可以抵御番木瓜环斑病毒。
科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
培育抗番木瓜环斑病毒的木瓜
一.限制性内切核酸酶—“分子手术刀”二.DNA连接酶—“分子缝合针”
三.基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
四.DNA的粗提取与鉴定
切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，又称 。
(不是一种酶，而是一类酶)
能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
一、限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
5’…T-C-G-A…3’
3’…A-G-C-T…5’
1.都可以找到一条中（心）轴线；
2.中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。
正向读与另一条链反向读的碱基顺序完全一致
实例1—EcR Ⅰ限制酶
识别特定序列为GAATTC
切割特定部位为G、A之间的磷酸二酯键
当限制酶在识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。
实例2——Sma Ⅰ限制酶
识别特定序列为CCCGGG
切割特定部位为C、G之间的磷酸二酯键
当限制酶在它识别序列的中轴线处将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是平末端。
问题1.请写出下列限制酶切割形成的黏性末端。
同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？
同尾酶：识别的靶序列不同，但是酶切后形成的黏性末端相同
2.结合右图，推断限制酶切一次可断开 个磷酸二酯键，产生 个游离的磷酸基团，消耗 分子水。
3.下图甲是一个DNA片段，箭头处代表不同限制酶的切点，据图回答：
(1)用EcR Ⅰ 酶切，能得到 种DNA片段；
(2)用PstⅠ 完全酶切，能得到 种DNA片段；
(3)要想获得抗病基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？
要切两个切口，产生四个黏性末端。
5.推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？
限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。
4.为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
该生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰。（如甲基化）
想一想：把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？
用同种限制酶切割(EcRⅠ)
二、DNA连接酶—“分子缝合针”
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
E.cli DNA连接酶、T4 DNA连接酶
★DNA连接酶没有识别特异性(相同或互补的黏性末端以及平末端都能连接)
（连接平末端效率远低于T4 DNA连接酶）
3.E·cli DNA连接酶的缝合作用
两个DNA片段要具有互补（相同的）黏性末端才能连接起来
把两个DNA片段黏性末端间的缝隙“缝合”起来，
注意：DNA连接酶可连接两个双链DNA片段中的DNA单链缺口，但不能直接连接两条单链的DNA！
DNA连接酶作用部位？
是磷酸二酯键（扶手）不是氢键
DNA连接酶将两个双链DNA片段“缝合”连接起来，形成一个双链DNA分子，恢复被限制酶切开的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。
T4 DNA连接酶还可以把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率相对较低。
T4 DNA连接酶的缝合作用
DNA连接酶 ——“分子缝合针”
DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
A A T T G
DNA聚合酶作用示意图
只能将单个核苷酸连接到已有的核苷酸链上，形成磷酸二酯键。
都能催化形成磷酸二酯键
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
4.比较DNA连接酶和DNA聚合酶
【核心归纳】与DNA相关的几种酶的比较
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
思考：根据所 学知识，完成以下填空：①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶
A.切断a处的酶为_______B.连接a处的酶为_______C.切断b处的酶为_______
a：磷酸二酯键；b：氢键
质粒、噬菌体和动植物病毒等。
将目的基因转入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别
三、基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
3.最常用的载体——质粒
一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
其基因属于细胞质基因。不是一种细胞器
为什么质粒能作为载体呢？它具有什么特点？
①能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
外源DNA片段（目的基因）插入其中
②有一个至多个限制酶切割位点
便于重组DNA分子的筛选
除了氨苄青霉素抗性基因外，四环素抗性基因，荧光蛋白基因等也可作为标记基因。
4.★作为载体所具备的条件及原因
使外源基因在受体细胞中稳定存在并复制，以扩增外源基因的数量
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。
也可用荧光蛋白基因做标记
重组DNA导入受体细胞不是100%，而且导入率较低
现有一段DNA，含有g1、g2、g3，若要将g2提取出来，如何操作？
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对? 如果不能，可能是什么原因造成的？
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
用相同的限制酶切割目的基因和运载体。产生相同末端，便于连接。
1.目的基因是要与运载体结合的，那如何处理质粒？
用DNA连接酶处理后会出现几种产物？(只考虑两两结合)
目的基因自身环化、质粒的自身环化、目的基因与质粒连接（正反向）
(1)获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是为了： 。但是使用该法缺点是容易发生 以及 ，为了避免上述情况发生，可采取的措施是 。
产生相同的黏性末端，便于连接
目的基因与质粒反向连接
目的基因、质粒的自身环化
分别使用两种限制酶（双酶切法）去切割目的基因和运载体
至少保留一个完整的标记基因，便于筛选
理由：防止目的基因和质粒自身环化和目的基因反向连接
最好选用不同的限制酶切割
利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在的差异，提取DNA，去除其他成分。
②DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，可提纯DNA。
①DNA不溶于酒精，细胞中某些蛋白质溶于酒精，初步分离DNA和蛋白质。
四、DNA的粗提取与鉴定
当NaCl的物质的浓度为0.14 ml/L时，DNA的溶解度 。此时DNA （溶解或析出）。当NaCl的物质的量浓度为2ml/L时，DNA的溶解度最大。
二苯胺有毒，现配现用并用棕色瓶存放
在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
富含DNA的材料(如新鲜洋葱、香蕉、菠菜和猪肝等)、研磨液、体积分数为95％的酒精、2 ml/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。
以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠，防止血液凝固。利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。
不能用哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核和线粒体，几乎不含DNA 。
（1）通过研磨释放 DNA
称取约30g 洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL 研磨液，充分研磨（可加入少量石英砂助研）。
①研磨的目的：②研磨时间不宜太长：③有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶： ④研磨不宜太用力
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量
研磨效果好（有利于充分研磨）
（2）过滤获取含DNA的上清液
可能含有核蛋白、多糖等杂质
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。
①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；②抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；③低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂。
不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。
低温放置几分钟的作用：
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%),静置2~3 min,溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌,卷起丝状物,并用滤纸吸去上面的水分;或者将溶液倒入塑料离心管中,在10000r/min的转速下离心5min,弃上清液,将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。
（3）冷却酒精析出DNA
取两支20mL的试管，各加入2ml/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
加入2ml/L氯化钠溶液
溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关
①材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够。②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。③二苯胺最好现用现配，否则二苯胺变成浅蓝色，影响鉴定效果。
1.怎么确认实验提取出来的是DNA所含杂质较少？若鉴定结果呈现蓝色比 较浅，说明什么问题？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。
2.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。
方法一：可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24：1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。
方法二：由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。
本实验只是对DNA进行了粗提取，请在阅资料，了解实验室提取纯度较高的DNA的一种方法，并与本实验中所使用的方法进行比较，总结两种方法的异同。
E.cli DNA连接酶
③ 有一个至多个限制酶切割位点
质粒、噬菌体、动植物病毒
切开DNA分子的磷酸二酯键
具有专一性（能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列）
② 能自我复制或整合到宿主DNA上。
④ 常有特殊的标记基因
1．细菌中广泛存在限制性内切核酸酶，当有外来DNA入侵时，该酶能够识别入侵者双链DNA中特定核苷酸序列并将其水解。以下相关叙述正确的是(　　)A．含有限制性内切核酸酶的细菌以RNA为遗传物质B．细菌中含有多种细胞器C．该酶可以保护细菌不受某些DNA病毒等的感染D．含有限制性内切核酸酶的细菌自身的DNA也能被该酶水解
2.图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MbⅠ、SmaⅠ4种限制性内切核酸酶切割的碱基序列和酶切位点分别为 C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题：
(1)若用限制酶Sma Ⅰ完全切割图1中DNA片段，产生的 末端是______末端，其产物长度为_____________________________。
537 bp、790 bp、661 bp